急性T淋巴细胞白血病β-肾上腺素受体的表达情况及临床意义研究
急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是以淋巴母细胞异常分化、恶性增殖为特征的血液疾病，约占15岁以下儿童恶性肿瘤的5%［1］，并呈逐年升高趋势［2］。根据淋巴细胞来源，ALL分为急性B淋巴细胞白血病和急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）。目前ALL病因不明，HUANG等［3］报道交感神经系统异常持续的兴奋会增加肾上腺素等的分泌，进而激活β肾上腺素受体（β-adrenergic receptor，β-AR）信号通路，导致肺癌的发生。CUI等［4］和LIU等［5］也提出精神压力及环境应激可通过β-AR影响肿瘤的发生及预后。然而，T-ALL与其他肿瘤的发病机制不同，且β-AR能否影响T-ALL的发生、发展及预后未见报道，有待进一步阐明。
β-AR是G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）的一种，分为β1-AR、β2-AR及β3-AR 3个亚型［6-7］，分布于人体正常的组织和器官，并在维持机体正常运转及代谢中发挥着重要作用。新近研究发现多数肿瘤中也存在β-AR的表达［8-9］，主要以β2-AR表达为主［3，8］，且是影响肿瘤进展的主要功能受体［10］。但ALL，尤其T-ALL上是否存在β-AR的表达，其表达情况如何，目前未知。因此，为进一步明确T-ALL患儿白血病细胞上β-AR的表达情况及β-AR与T-ALL患儿危险度及预后的相关性，本研究拟检测T-ALL患儿骨髓中原代白血病细胞上β-AR 3个亚型的表达情况，并分析不同β-AR亚型与T-ALL患儿危险度及预后的相关性；同时进一步分析β-AR是否为T-ALL患儿预后不良的危险因素，为明确β-AR与T-ALL患儿预后的关系提供一定的理论依据。
1 资料与方法
1.1 数据库分析
检索基因表达交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）、癌基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）、肿瘤免疫评估资源（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）数据库，查询β1-AR、β2-AR及β3-AR在白血病及其他恶性肿瘤细胞上的表达水平，同时查询β1-AR、β2-AR及β3-AR的表达水平对肿瘤预后的影响，并归纳总结数据。
1.2 临床资料
收集2019年—2022年于遵义医科大学附属医院治疗的T-ALL患儿的临床资料及骨髓标本，共40例，根据诊治情况及疗效分为T-ALL初诊组及T-ALL缓解组，其中T-ALL初诊组23例，T-ALL缓解组17例；同时收集非血液疾病患儿的临床资料及骨髓标本15例作为对照组。纳入标准：（1）年龄0~14岁；（2）均进行血常规、骨髓细胞形态学检测、分子生物学及细胞遗传学检查；（3）符合《儿科学》［11］白血病的诊治标准；（4）T-ALL初诊者就诊时未接受过其他治疗；（5）T-ALL缓解者均为我院治疗后缓解；（6）患儿家属知情同意。排除标准：（1）因各种原因未能按照规范治疗的患儿；（2）有严重的重要脏器疾病病史，如心、肝、肾等疾病；（3）合并其他基础疾病并影响疗效的患儿。本研究方案经遵义医科大学附属医院伦理委员会批准（批准号：KLL-2022-474）。
1.3 资料收集与分组
按照德国柏林-法兰克福-蒙斯特（Berlin Frankfurt Munster，BFM）及美国儿童肿瘤治疗协作组（Children's Oncology Group，COG）临床危险度分级标准［11］，将T-ALL初诊组患儿分为中危亚组（9例）及高危亚组（14例）。同时将T-ALL初诊组患儿按预后结果进行分组，死亡及复发者为预后不良亚组（10例），疗效好并完全缓解者为预后良好亚组（13例）。收集患儿的临床资料，包括白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）、血红蛋白（HB）、初诊时骨髓白血病细胞比例、诱导化疗8 d后外周血中有/无白血病细胞及化疗15 d后骨髓中有/无白血病细胞。
1.4 免疫印迹试验（Western blot）检测T-ALL细胞β-AR表达
1.4.1 人骨髓T-ALL细胞的提取：采用Human T Cell Enrichment Cocktail联合Ficoll淋巴细胞分离液梯度分离提取T-ALL细胞。步骤为：收集患儿骨髓标本2 mL，加入100 μL Human T Cell Enrichment Cocktail并混匀，室温静置20 min。取离心管加入2 mL淋巴细胞分离液后将骨髓标本沿管壁缓慢铺于分离液上层；离心后吸取第1、2层交界处的白膜移入另一离心管，加入BSA液，混匀；离心后弃上清液，保留沉淀，先后加入1 mLBSA液及2 mL红细胞裂解液混匀；离心后弃上清液，加入10 mL BSA液混匀；离心后弃上清液，管底内细胞沉淀即为T-ALL细胞。
1.4.2 Western blot：收集蛋白上清液，进行BCA蛋白定量。定量后进行蛋白变性。进而制胶、上样、电泳、切胶、转膜、洗膜、封闭、洗膜、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜、曝光，最后采用软件Image Lab检测蛋白的光密度值（IOD）；目的蛋白相对表达量=IOD（目的蛋白）/IOD（内参）。
1.5 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni校正；不符合正态分布的计量资料以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用非参数检验；计数资料采用相对数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher's确切概率法。采用Pearson相关性分析或Spearman秩相关检验分析β-AR与T-ALL患儿危险程度的相关性，同时采用基于R语言Performance Analytics包进一步行相关性分析。采用多因素Logistic回归分析探究T-ALL患儿高危的影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 β-AR基因在恶性肿瘤中表达情况分析
GEPIA数据库检索β-AR 3个亚型β1-AR、β2-AR及β3-AR在31种肿瘤上的表达情况，结果发现：β1-AR在前列腺癌中表达水平较高，β2-AR在血液及前列腺等相关恶性肿瘤中表达水平较高，β3-AR在恶性肿瘤中的表达水平极低。通过GEPIA数据库、TCGA数据库及GTEx数据检索3种β-ARs基因在白血病上的表达情况，结果发现：与正常血液组织比较，急性髓系白血病血液组织β-AR基因的表达较高，主要以β2-AR基因表达为主，其次是β1-AR基因，而β3-AR基因表达水平较低。检测结果未见β-AR在ALL上的表达数据。
2.2 β-AR基因表达与部分肿瘤预后的相关性
通过GEPIA数据库、TCGA数据库检索β-AR基因对白血病等恶性肿瘤患者预后的影响，并总结分析。结果共检索出包括急性髓系白血病（AML）在内的33种恶性肿瘤中不同β-AR基因对其生存率的影响，并发现β-AR基因可影响小部分肿瘤患者的生存率。进一步统计分析发现不同β-AR基因对不同肿瘤患者的生存率影响不同，其中β1-AR基因可影响宫颈癌（CESC）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、胰腺癌（PAAD）、肉瘤（SARC）及黑色素瘤（SKCM）患者的生存率，β2-AR基因可影响肾癌（KIRC、KIRP）、肺腺癌（LUAD）及胸腺癌（THYM）患者的生存率，β3-AR基因可影响肾透明细胞癌（KIRC）患者的生存率。检索结果未见β-AR基因对ALL患者预后影响的数据。
2.3 T-ALL患儿一般资料
共收集T-ALL患儿骨髓标本及非血液疾病患儿骨髓标本55例，其中对照组15例，T-ALL初诊组23例，T-ALL缓解组17例。3组男、女患儿分别为12例、3例，19例、4例，15例、2例，患儿性别比较差异无统计学意义（χ2=0.405，P=0.808）。3组患儿平均年龄分别为（7.1±3.3）、（6.9±2.7）、（7.6±3.3）岁，年龄比较差异无统计学意义（F=0.291，P=0.749）。
2.4 患儿T-ALL细胞β-AR蛋白表达情况
Western blot结果显示，3组患儿T-ALL细胞β1-AR、β2-AR、β3-AR蛋白表达比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中T-ALL初诊组β1-AR、β2-AR、β3-AR蛋白表达水平高于对照组、T-ALL缓解组（P<0.05）。
2.5 中危亚组与高危亚组临床资料及β-AR蛋白表达比较
高危亚组β3-AR蛋白表达高于中危亚组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组WBC、HB、PLT、初诊骨髓白血病细胞比例、诱导化疗8 d后外周血白血病细胞、β1-AR、β2-AR比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.6 T-ALL患儿高危影响因素的多因素Logistic回归分析
以危险度为因变量（赋值：中危=0，高危=1），以β3-AR（赋值：实测值）、化疗15 d骨髓白血病细胞（赋值：无=0，有=1）为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，β3-AR升高及化疗15 d后骨髓中有白血病细胞是T-ALL患儿高危的危险因素（P<0.05）。
2.7 预后良好亚组和预后不良亚组临床资料及β-AR蛋白表达比较
预后不良亚组β3-AR高于预后良好亚组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组WBC、HB、PLT、初诊骨髓白血病细胞比例、化疗8 d外周血白血病细胞、化疗15 d骨髓白血病细胞、β1-AR、β2-AR比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.8 T-ALL患儿预后不良影响因素的多因素Logistic回归分析
以预后为因变量（赋值：0=预后良好，1=预后不良），以β3-AR（赋值：实测值）为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，β3-AR升高是T-ALL患儿预后不良的危险因素（P<0.05）。
2.9 β-AR与T-ALL患儿临床资料、危险度及预后的相关性分析
相关性分析结果示，β2-AR与WBC、初诊骨髓白血病细胞比例、化疗15 d骨髓白血病细胞呈正相关，β3-AR与T-ALL患儿危险度、预后呈正相关（P<0.05）。
3 讨论
β-AR广泛存在于机体的正常组织和脏器上，不仅是膜结构的重要组成部分，还可与多种G蛋白亚型（Gs、Gi、Gq等）结合，从而产生多种生物学效应。β-AR分为β1-AR、β2-AR及β3-AR 3个亚型，其中，β1-AR主要位于心脏组织，可增强心肌收缩，增加心率等；β2-AR主要位于血管、支气管及胃肠道的平滑肌，可引起血管扩张及平滑肌舒张等；β3-AR主要位于脂肪组织，主要调节脂肪代谢等。β-AR在维持着机体正常活动及代谢中发挥着重要作用。
随着对β-AR的深入研究，发现大多数恶性肿瘤上也存在β-AR的表达，如乳腺癌［12］、前列腺癌［13］等。本研究通过GEPIA数据库、TCGA数据库、GTEx数据库分析发现大多数肿瘤中存在β1-AR及β2-AR的表达，而β3-AR的表达极少，且不同肿瘤上3个β-AR亚型的表达存在差异。但白血病上β-AR的表达情况仅见于AML，为β2-AR异常高表达。ALL是不同于AML的另一类型白血病，ALL尤其是T-ALL上β-AR的表达情况目前未知。为此，本研究检测了T-ALL患儿骨髓中原代白血病上β-AR的表达，结果发现T-ALL上存在β-AR的表达；与正常对照者及T-ALL缓解者比较，T-ALL初诊患儿原代白血病上β1-AR、β2-AR及β3-AR蛋白均为异常高表达（P<0.05），而T-ALL缓解者上β-AR的表达与正常对照者比较，差异无统计学意义（P>0.05）。分析其原因可能为：（1）β-AR可能在T细胞分化早期为高表达，但在T细胞分化成熟后，其表达水平降低；（2）β-AR的表达在T细胞分化早期可能较低，而当β-AR的表达异常增加时，T细胞前体可能会恶变成T-ALL细胞。由此可推测β1-AR、β2-AR、β3-AR均有可能参与了T-ALL的发病。
结合文献报道及KEGG PATHWAY数据库分析，本研究发现作为GPCRs的一员，激活的β-AR可活化GPCRs所介导的腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC），进而促进三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）转化为环状3'-5'腺苷单磷酸（cyclic adenosine monophos-phate，cAMP）［14］。cAMP主要通过调控两个下游的效应系统进而调节多种生物学功能，即cAMP可分别激活下游的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）［15］及环腺苷酸结合蛋白（exchange protein directly activated by cAMP，Epac）［16］。被激活的PKA可活化信号传导及转录激活因子（STAT3）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、核因子κB（NF-κB）等转录因子［17］；被激活的Epac可活化其下游的与肿瘤发生、发展密切相关的信号通路，如c-Jun氨基末端激酶（JNK）/NF-κB、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等信号通路［18-20］，进而干预增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶（MMPs）、血管内皮生长因子（VEGF）、细胞周期蛋白D1（CCN D1）、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNK-α）等与肿瘤生长密切相关的分子，从而促进肿瘤细胞的生长并诱导其分化［21-22］。此外，活化的β-AR还可激活Src家族酪氨酸激酶、上调炎症、生长等因子，进而激活JAK2/STAT3信号通路［23］。这些信号分子及通路直接或间接参与肿瘤的增殖、周期、凋亡及侵袭等［24-25］。由此可见，β-AR及其下游的相关信号分子通路直接或间接参与了肿瘤的发生、发展，并可能与肿瘤的预后相关［26］。
对此，本研究再次通过GEPIA数据库、TCGA数据库检索β-AR对白血病等恶性肿瘤患者预后的影响，并发现β-AR可影响小部分肿瘤患者的预后，并且不同β-AR对不同肿瘤患者的预后影响不同。此外，β-AR表达水平的高低对不同的肿瘤患者的生存率影响亦不相同，如：低表达的β1-AR是CESC、PAAD、SARC及SKCM患者预后的不良因素，而高表达的β1-AR是LUSC患者预后的不良因素；同样，低表达的β2-AR是KIRC、KIRP、LUAD患者预后不良的影响因素，而高表达的β2-AR是THYM患者预后不良的影响因素；此外，高表达的β3-AR是KIRC患者预后不良的影响因素。此外，GAO等［27］发现β1-AR的高表达与多发性骨髓瘤发病相关，且为预后差的独立预测指标。OGAWA等［28］发现β2-AR与结直肠癌患者术后的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）密切相关，结直肠癌中β2-AR阳性患者的OS及DFS远低于β2-AR阴性患者。由此可见，β-AR在恶性肿瘤预后中起到了重要作用。但未发现关于β-AR对ALL尤其对T-ALL患者预后影响的数据。故本研究通过收集T-ALL患儿的临床资料并分析β-AR对T-ALL患儿预后的影响，结果发现β1-AR、β2-AR与T-ALL患儿的危险度及预后无相关性，而β3-AR与T-ALL患儿的危险度及预后不良呈正相关；T-ALL患儿初诊时β3-AR表达水平越高，其发生高危的风险就越大，且预后也越差。因此可知β3-AR异常高表达是T-ALL患儿预后不良的危险因素。
综上，本研究的结果表明：多种肿瘤存在β-AR的表达，且β-AR与部分肿瘤的预后密切相关；T-ALL上存在β-AR的表达，且T-ALL初诊者原代白血病细胞中β-AR为异常高表达，而T-ALL缓解后其原代白血病细胞中的β-AR的表达水平下降；β3-AR与T-ALL患儿的危险度及预后不良呈正相关，且β3-AR的异常高表达是T-ALL患儿发生高危及预后不良的危险因素。这为进一步明确T-ALL病因、预测T-ALL预后及其靶向治疗提供了一定理论依据。
参考文献略
