干货｜WB 检测细胞自噬：从原理到操作，一篇讲透！
自噬（autophagy）是细胞的一种重要的程序性细胞死亡方式，属于II型程序性细胞死亡。
程序性细胞死亡是一个广泛的概念，涵盖了多种细胞死亡方式，如凋亡、铁死亡、焦亡等，而自噬在其中扮演着独特的角色。细胞自噬是一种高度保守的细胞内物质循环机制，它通过溶酶体的降解作用，选择性地清除细胞内受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器，例如线粒体、内质网碎片以及蛋白质聚集体等。这些被降解的物质被分解为游离的小分子，如氨基酸、脂肪酸和核苷酸等，随后被细胞回收利用，以维持细胞的正常代谢和生理功能。
自噬在细胞的生存和稳态维持中发挥着至关重要的作用，它被认为是机体的一种自我保护机制。例如，在细胞面临营养匮乏、缺氧或氧化应激等不利环境条件时，自噬可以被激活，通过降解细胞内的非必需成分来提供能量和营养物质，从而帮助细胞度过难关。此外，自噬还可以清除细胞内的有害物质和病原体，维持细胞内的稳态和功能完整性，对于细胞的健康和机体的正常生理功能至关重要。
一、细胞自噬形式
细胞自噬主要包括三种形式：微自噬（microautophagy）、巨自噬（macroautophagy，通常也称作自噬）和分子伴侣介导的自噬（Chaperone - mediated autophagy，CMA）。这三种形式的主要区别在于其产物（货物）进入溶酶体的分子途径。
- 巨自噬（macroautophagy） ：细胞的整个区域被双层膜包裹形成自噬体，这些自噬体随后与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，其内容物被其中的蛋白酶降解。在大多数情况下，当我们提到自噬时，通常是指巨自噬（以下提及的自噬也均指巨自噬）。
- 微自噬（microautophagy） ：细胞器或内含物的囊泡直接与溶酶体相互作用并融合。微自噬比巨自噬更具特异性，其过程可由受损细胞器表面的信号分子触发。
- 分子伴侣介导的自噬（Chaperone - mediated autophagy，CMA） ：胞质内的蛋白质通过胞质伴侣与溶酶体融合。具体而言，分子伴侣与底物蛋白氨基酸序列中的五肽相互作用，例如底物蛋白与溶酶体上的 LAMP - 2A 结合，随后被转运至溶酶体中进行降解。
二、细胞自噬发生过程
细胞自噬的本质是细胞内膜结构的重排，其发生过程大致可以分为以下四个阶段：自噬的起始→隔离膜和自噬体的形成→自噬体与溶酶体的融合→自噬溶酶体的裂解与产物回收。
步骤 1：自噬的起始
细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个类似“脂质体”的小膜结构，随后该结构不断扩张。不过，它并非呈球形，而是扁平的，类似于半球形，由两层脂双层组成，形似一个碗。这种碗状结构能够包裹受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器。在电镜下可以观察到这种类似碗状的结构，被称为吞噬泡（Phagophore），它是自噬发生的重要标志之一。
步骤 2：隔离膜和自噬体的形成
吞噬泡不断延伸，将胞浆中的各种成分，包括细胞器，全部包裹在内，随后“收口”，形成一个密闭的球状结构，即自噬体（autophagosome）。在电镜下观察到的自噬体是自噬发生的又一重要标志。自噬体具有两个显著特征：一是双层膜结构；二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。
步骤 3：自噬体与其他细胞内膜结构的融合
自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体发生融合（此处“可”字表明这种情况并非必然发生，而是具有一定的选择性）。这一过程进一步促进了细胞内物质的整合与转运。
步骤 4：自噬体与溶酶体的融合及裂解
自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome）。在此过程中，自噬体的内膜被溶酶体酶降解，两者的内容物合为一体。自噬体中的“货物”也被降解，产物（如氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用。而降解后的残渣则可能被排出细胞外，或者滞留在胞浆中。
细胞自噬的这一完整过程，不仅体现了细胞内膜结构的动态变化，还反映了细胞在应对损伤和代谢需求时的高度适应性和自我调节能力。
三、细胞自噬5个特性
- ①消化自身：细胞自噬看似是一种自我消化的过程，似乎对细胞不利，但事实上，细胞在正常生理状态下很少发生自噬。只有在存在诱发因素（如营养缺乏、缺氧或细胞损伤等）时，自噬才会被激活。由于这些诱发因素在细胞生存环境中可能频繁出现，因此细胞保持一种低水平的基础自噬活性，以维持细胞内环境的稳态。
- ②过程快速：细胞自噬的过程非常迅速。一旦被诱导，自噬体（autophagosome）可在8分钟内形成，而自噬溶酶体（autolysosome）在2小时后基本完成降解并消失。这种快速的自噬过程使得细胞能够迅速适应恶劣的环境条件，如营养匮乏或缺氧等，从而增强细胞的生存能力。
- ③可诱导特性：细胞自噬具有显著的可诱导性，主要体现在两个方面。首先，自噬相关蛋白能够快速合成，这是自噬启动的准备阶段；其次，自噬体能够快速大量形成，这是自噬执行的关键阶段。这种快速的诱导机制使得细胞能够在短时间内启动自噬过程，以应对各种应激条件。此外，细胞自噬的批量降解特性与蛋白酶体降解途径有显著区别，后者主要负责降解少量的、特定的蛋白质。
- ④“捕获”胞浆成分的非特异性：细胞自噬在“捕获”细胞质成分时表现出非特异性。由于自噬过程需要快速且大量地降解细胞质成分，因此特异性并不是首要考虑的因素。这种非特异性与自噬的应急特性相适应，使得细胞能够在短时间内清除大量受损或多余的细胞器和蛋白质，从而维持细胞的正常功能。
- ⑤保守性：细胞自噬是一种高度保守的细胞过程。由于自噬对细胞的存活具有重要意义，因此它在不同物种之间以及各种细胞类型（包括肿瘤细胞）中都普遍被保留下来。这种保守性表明自噬在细胞进化过程中具有不可替代的作用，是细胞应对各种应激条件和维持稳态的重要机制。
四、细胞自噬相关的蛋白
细胞自噬是一个高度有序的细胞过程，涉及多种自噬相关蛋白（Atg proteins）的精细调控。这些蛋白在自噬的起始、自噬体形成、底物识别、线粒体自噬以及自噬调节等不同阶段发挥关键作用。
1. 自噬起始相关蛋白
- ULK1复合体：ULK1（Unc-51-like kinase 1）是自噬起始的核心激酶，其活性主要受mTORC1的调节。在营养充足时，mTORC1通过磷酸化ULK1抑制其活性，阻止自噬的发生；而在饥饿或其他应激条件下，mTORC1失活，ULK1得以去磷酸化并被激活，进而启动自噬过程。
- PIK3C3/VPS34复合体：PIK3C3（磷脂酰肌醇3-激酶）是自噬起始阶段的关键酶，它与BECN1（Beclin1）、AMBRA1等蛋白相互作用，催化生成磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）。PI3P的产生能够招募含有PX结构域或FYVE结构域的蛋白，促进自噬体的形成。
2. 自噬体形成相关蛋白
- ATG5-ATG12-ATG16L1复合体：ATG12与ATG5通过共价键结合后，与ATG16L1形成复合体，该复合体直接参与自噬体的形成和成熟，促进自噬体的延伸和闭合。
- LC3（微管相关蛋白1轻链3）：LC3是自噬体膜的重要标记蛋白。在自噬过程中，胞质型LC3-I被加工为膜型LC3-II，LC3-II能够与自噬体膜结合，促进自噬体的延伸和闭合，是自噬体形成的关键标志。
3. 自噬底物识别相关蛋白
- P62/SQSTM1：P62（也称为SQSTM1）是一种选择性自噬受体蛋白，能够识别并结合受损的蛋白质和细胞器。通过其LC3相互作用区域（LIR），P62能够与LC3结合，将底物靶向到自噬体中，进而被降解。
- Rpl12：Rpl12是核糖体大亚基蛋白，作为核糖体自噬（ribophagy）的保守受体，参与核糖体的选择性降解，有助于维持细胞内的蛋白质稳态。
4. 线粒体自噬相关蛋白
- PINK1和Parkin：在线粒体损伤时，PINK1在受损线粒体外膜稳定积累，招募E3泛素连接酶Parkin。Parkin通过泛素化修饰线粒体膜蛋白，标记受损线粒体，启动线粒体自噬，从而清除损伤的线粒体。
- BNIP3和NIX：BNIP3和NIX均含有LC3相互作用区域（LIR），能够直接与LC3结合，促进线粒体自噬。它们在清除损伤线粒体、维持细胞能量代谢和细胞稳态中发挥重要作用。
5. 自噬调节蛋白
- BECN1（Beclin1）：BECN1是PIK3C3复合体的关键组分，通过与Bcl-2家族蛋白相互作用调节自噬。Bcl-2家族蛋白能够结合BECN1，抑制PIK3C3的活性，从而抑制自噬的起始。
- AMBRA1：AMBRA1在自噬起始中发挥重要作用，其与ULK1和PIK3C3复合体相互作用，促进自噬体的形成，是自噬起始阶段的关键调节因子。
- PPP1R15A：PPP1R15A通过调节BECN1和ATG5的表达，促进自噬体和自噬溶酶体的形成，对自噬的调控具有重要意义。
五、使用WB技术检测细胞自噬
1. LC3：自噬的关键标记蛋白
LC3（全称微管相关蛋白1轻链3，MAP1LC3）是贯穿整个自噬过程的核心蛋白，目前被广泛认可为自噬的标志性蛋白。LC3蛋白的含量及其形态变化是评估细胞自噬活性的重要指标。LC3蛋白有多种亚型，其中LC3A、LC3B和LC3C是最常见的。在自噬过程中，胞质型的LC3-I会与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，转变为膜型的LC3-II，并在自噬体膜上富集。通过Western Blot（WB）技术检测LC3B-II与LC3B-I比值的变化，可以有效评估细胞自噬的程度。自噬增加时，LC3-II的相对含量显著上升，表明自噬体的形成和成熟过程活跃。
2. P62：自噬底物的指示蛋白
P62（也称为SQSTM1）是一种选择性自噬受体蛋白，在自噬体形成过程中发挥重要作用。P62能够识别并结合受损的蛋白质和细胞器，并通过其LC3相互作用区域（LIR）与LC3结合，将这些底物靶向到自噬体中。进入自噬体后，P62连同其结合的底物一起被自噬溶酶体中的蛋白水解酶降解。因此，P62蛋白的表达量可以作为评估自噬活性的重要指标，其表达水平与自噬活性呈负相关。自噬活性高时，P62的降解增加，其蛋白水平降低；反之，自噬受阻时，P62的积累增加。
3. 样品处理与检测注意事项
- 样品新鲜度：LC3-1对反复冻融非常敏感，容易降解。因此，在进行WB检测时，建议使用新鲜制备的样品上样，以确保LC3蛋白的完整性和检测结果的准确性。
- 蛋白提取方法：LC3是一种脂膜蛋白，其提取效率会受到蛋白提取方法的影响。在提取蛋白时，建议采用超声处理，这有助于提高LC3蛋白的提取效率，使其更容易被检测到。超声处理可以破坏细胞膜结构，使LC3蛋白充分释放到提取液中，从而提高WB检测的灵敏度。
