细胞核质分离方法（基于温和去垢剂裂解与离心技术）

一概述

细胞核质分离（nucleus-cytoplasm fractionation）是一种常用于研究蛋白质或RNA在细胞内亚细胞定位的技术，主要通过物理破碎或温和裂解细胞膜，结合低速离心等步骤，实现细胞核与胞质组分的分离。该方法可帮助明确信号通路中蛋白的核转位状态、分析核质RNA的分布，或开展亚细胞蛋白质组学研究。常见的分离方法包括非离子去污剂（如NP-40）裂解法、蔗糖梯度离心法或使用商业化试剂盒，需根据实验需求、细胞类型和下游分析方式选择合适方案。

二实验原理

利用非离子去垢剂选择性溶解细胞膜，保持核膜完整，通过差速离心实现分离：

1. 低渗缓冲液：使细胞肿胀，弱化细胞膜。

2. 去垢剂裂解：溶解细胞膜及胞质膜结构，释放胞质成分。

3. 离心分离：低速去除碎片→高速沉淀完整细胞核。

三核心缓冲液配制

表1 细胞裂解缓冲液（500 mL）

表2 核洗涤缓冲液（200 mL）

四实验步骤（全程4℃操作）

一、细胞预处理

细胞收集：

贴壁细胞：PBS洗2次→细胞刮收集（避免胰酶损伤膜蛋白）。

悬浮细胞：300 × g, 5 min → PBS洗2次。

组织样本：液氮研磨→裂解缓冲液悬浮（100 mg/mL）。

二、裂解与分离

低渗裂解：

细胞重悬于预冷裂解缓冲液（10⁷细胞/mL）。

冰浴15 min（每隔5 min轻柔颠倒混匀）。

去垢剂裂解：

加入NP-40至终浓度（关键：用移液器吹打≤3次）。

冰浴10 min →溶液变粘稠（显微镜检查：>90%细胞膜破裂）。

差速离心：

表3 差速离心步骤

三、组分纯化与保存

细胞核洗涤：沉淀用核洗涤缓冲液重悬→ 800 × g, 10 min →重复2次。

细胞质处理：上清过0.22 μm滤膜→超滤浓缩（10 kDa MWCO）。

保存：

细胞核：重悬于储存液（50%甘油 + 20 mM DTT）→ -80℃分装。

细胞质：加RNase抑制剂→ -80℃速冻。

五注意事项

表4 避免核损伤

表5 防止交叉污染

六遇到问题及解决方案

表6 常见问题及解决方案

参考：

[1] Liu X, Fagotto F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Sci Signal. 2011 Dec 13;4(203):pl2. doi: 10.1126/scisignal.2002373. PMID: 22169476.

[2] Lo Piccolo L, Bonaccorso R, Onorati MC. Nuclear and Cytoplasmic Soluble Proteins Extraction from a Small Quantity of Drosophila's Whole Larvae and Tissues. Int J Mol Sci. 2015 Jun 1;16(6):12360-7. doi: 10.3390/ijms160612360. PMID: 26039237; PMCID: PMC4490448.