Western blot如何做

Western blot

蛋白质的提取

（低温、？在冰上进行），提前预冷离心机：

1单层贴壁细胞总蛋白提取：培养瓶内的细胞消化下来，900rpm离心3min，用加 100μl含 PMSF 的蛋白裂解液（PMSF+RIPA，1：99）重悬，冰上裂解30min。也可以用生理盐水洗2遍，然后直接加入裂解液。可以使用枪头刮细胞，一般细胞直接裂解就可以下来了。（加裂解液的比例：细胞15cm皿满的1/4，加300μl的裂解液（按照底面积换算，这个裂解液加得好少，换算成6孔板是加16.7μl）。花姐一般6孔板的细胞，加入100μl裂解液或者300μl（看心情加），只要？终蛋白上样的浓度不小于1.5μg/μl，就可以）

如果是需要抑制磷酸化，抗氧化等需要添加以下试剂：PPIC（抑制磷酸化）和DTT（抗氧化）。

4度12000g 离心15min。将离心后的上清（即蛋白质）转移到新 EP 管中，可进行定量。

加？处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

（1）由于受？的影响，一些细胞可能会脱落下来，所以除了按照上述？作外还应收集培养液中的细胞。将细胞培养液收集起来，于 4 度 2500rpm 离心 5min。

（2）弃上清，然后加入 4 ？  PBS 并用移液器轻轻吹打沉淀物，弃上清。重复 3 次，弃上清。

（3）加 100 μl含 PMSF 的裂解液，冰上摇动（可以直接放在冰上裂解）裂解 30min。

（4）将裂解后的液体与培养瓶中得到的裂解液混合，4度12000g 离心15min。将离心后的上清（即蛋白质）转移到新 EP 管中，可进行定量。

裂解液加入多少，按细胞量来估计，一个6孔板长满大约加入100μl。

上清蛋白收样

加刺激前把细胞培养液弃去，用生理盐水洗一遍，换成减血清培养基（opti-M，无血清蛋白干扰)，刺激完成后，贴壁细胞弃去培养基，加入裂解液50-60μl，冰上裂解20分钟；悬浮细胞刺激完成后离心去上清加入裂解液（可全部吸入EP管中，离心分离上清和沉淀）50-60μl，冰上裂解20分钟。

上清（无血清培养基）：？醇：氯仿=4:4:1比例加入？醇和氯仿，混匀，4℃ 12000g 15min离心，液体分三层，中间白膜层为蛋白质，弃上清，加入等体积？醇，吹打均匀，4℃ 13000g 15min离心，此时蛋白质沉在底部，大枪套小枪弃去上清液体，晾干，加裂解液和5x loading煮蛋白。）

蛋白变性：提前预热变性仪至100℃，加入loading buffer（按体积来，蛋白：loading buffer=4:1）,变性仪变性8-10min（10min），放到不那么烫的时候，收至-30℃冰箱。

在中大实验室会用1×loading 来平衡不上样的孔，以前在省？的时候就没有这样用过。这个loading 是自己配制的，不是买的那种，比较便宜。（可以用，也可以不用，用的话，比如有的样本只有10μl，可以10μl样本上完，再上10μl的1×loading，1×loading放在4度就可以，这样也不用每次提前拿出来融化）

进行BCA定量之后跑胶，如果是定性分析，可以不需要定量。定量分析要确保上样蛋白量一样，使内参齐平。1.5mm，15wells的胶每孔体积是30μl，上样量？多20μl，上样量可以是5-20μl，如果蛋白浓度很低，可以酌情增加体积，但是上样要小心，防止蛋白逸出。蛋白marker上1-2μl。一般是2μl。（DNA跑小鼠鉴定的时候一般上样2-3μl marker，一般上2μl）

凝胶配方

一般配胶，下层胶（分离胶）一块8？就很足够了，多余的液体不要丢掉，用来判断胶是否凝了。等到凝固再丢掉，凝固毒性才能降低。（配胶的50？离心管可以直接丢掉，也可以清洗干净，里面的胶敲击即可掉落，下一次用来配制同样浓度的胶）配胶？是现配先用，可提前一天配制，配好用ddH2O浸泡在盒子里，4度冰箱保存。其实一个月的胶也是可以用的，只要不长菌，看起来干净。但是？尽快使用，不要增加不可控的因素。

如果配胶出现泳痕，会对结果造成比较大的影响，如果那个分子量大概在那里的话，如果分子量不在泳痕，可以酌情使用。出现这个情况大概率是下面的封口胶条（灰色的）损耗了，密闭性不好。胶上有气泡，大概率也是这个封口胶条的问题，更换新的胶条即可。

（1）配胶之前需要用洗洁精把玻璃板子洗干净，一般使用1.5mm厚的板子，15wells的。用海绵洗玻璃板，不可以用试管刷，容易对板子造成划痕。每次用完把玻璃板冲干净，板子的侧面放在架子底面晾干，因为用另一面晾干，长期以往会使那一面不平齐，以后配胶容易漏。用ddH2O验漏，一般验漏15min以上，如果还是漏，可以重新验（浪费时间，也可以直接不验漏，但？还是验一下），或者直接夹多一个大枪头在夹子的位置。把玻璃板夹在配胶架上，记得厚玻璃板这样子的|\_/|一端，朝上。

（2）验漏完之后，倒掉水，用吸水纸稍微吸干水，移到通风橱内配胶（temed是有挥发性毒性的），将试剂分别加入50？离心管中，摇匀后注入玻璃板，或者直接倾倒入玻璃板，用枪头注入的方法比较好，因为这样不容易在玻璃板外壁形成凝胶。但是之后也可以洗掉，只是比较麻烦。按配方来进行，？后再加入APS，？？后加入Temed。因为凝胶原理是temed催化APS产生自由体，从而促进凝胶，一旦加入这两个物质，凝胶过程开始。不过分离胶（下层胶）凝固的速度比较慢，相对于上层胶来说。

（3）分离胶加到绿色夹板的？即可，如果会漏，可以稍微多加一点，给一点漏的空间，但是也不要太多，浓缩胶压缩得不好，样本的起点不一致，会导致后续裁膜不准确。加完之后用1？或者更多的纯水或无水乙醇液封压平（无水乙醇可以消除气泡，注入胶的时候吸二档打一档，就几乎不会有气泡，除非是粘在枪头外壁的，可以更换枪头），液封的时候用力小点，防止胶被荡起来，导致不平。大约15-20min（跟温度和风速有关系，可以看多余的胶是否凝固来判断）可以凝固，但是保险起见还是30min（1-2h也没有问题）。

（4）把梳子洗干净，擦干晾干（记得看清楚厚度和孔数）→先将浓缩胶的前部分配好，除了先不加APS和temed，倒干液封的液体→用吸水纸擦干，加满（吸二档打一档）后马上插梳子，用力均匀不要着急，垂直着插进去，不要一高一低，如果发现没插好，立马擦干净梳子，摇匀玻璃板里的胶，重新再插，实在不行就放弃这块胶。→30min后将胶取下，水龙头的水洗掉外壁多余的胶（也可以不用），纯水保存于4度，用大枪头盒装着（？使用），或者也可以用湿的吸水纸包着，放到PE手套里。

上样和电泳：夹好胶（胶外壁多余的胶要洗掉，不洗也没事），2块胶对面夹，若1块胶，对面夹蓝色塑料板，薄玻璃板（即短面）朝内→红对红，黑对黑，对好槽→1×电泳液加满电泳槽中间，外面1-2块胶加至2片刻度，3-4块胶加至4片刻度（若中间槽漏液严重，直接都给加满到4片刻度）→上样，左右两边角落各加marker（一般是10-180kDa（省？和黄曦实验室常用），还有另一种是10-245 kDa（省？））（都是2μl，或者左边6μl，右边3μl，marker明显的是左边，这样就可以分清左右）→从左往右加样本（正面来看），如果是要一块胶上要裁成2块膜，在分隔的地方加1个marker分开，可以分得开，如果还有位置，可以中间隔2个marker。→上样时沿厚玻璃板向下，进入孔1/3位置缓慢打，打到二档，离开电泳液再放手。吸样品后枪头外壳用吸水纸擦干，避免污染电泳液导致上样量不准。（电泳液里的样本会沉积一些到孔里，导致上样量不准。）要避免样品逸出，导致上样量不准。上样时枪头勿碰胶。→连接电源，红对红，黑对黑。

电泳：先恒压80V×20min（大概20min），待样品跑完浓缩胶，marker条带出现分层（时间要设置九一点，不要刚好20min，可以设置1h40min，因为如果有时间的话，？全程跑80V，跑出来的条带会更加好看）→然后换成恒压120V×80min（大概80min），注意偶尔去观察一下，不要让样本跑出胶，可以直到溴酚蓝跑出胶（？下方的红色或蓝色的，比较厚的就是溴酚蓝，跑出去是没事的）。也可以样本跑到下方绿线（距离跑出去大概1cm远），停止，关掉电源（电泳时间稍微设置长一点，要及时观察，千万不要让样本跑出去）。跑到多下面，得看蛋白的分子量，如果蛋白分子量很小，需要跑得开一点，就需要跑下面一点。如果蛋白分子量很大，为了分得更开，也可以跑出去。电泳液可以回收4-5次，写上“正”字和回收日期。一般在黄曦实验室，？多用2次。

转膜

转膜液要提前预冷，可以直接埋在制冰机里。跑完胶尽快转膜（省？要尽快，但是黄曦实验室可以让它转完，午睡之后再来处理，其实可以早上早点跑上，这样就可以在中午下班十二点之前转完膜）。剪下PVDF膜8cm×4cm，？醇活化5min（大概就好，先活化上，再浸泡转膜滤纸在转膜液中，活化剩下的？醇，省？会回收，下一次继续活化用，没避光，直接放在50？离心管中，黄曦实验室是直接倒入转膜液中，？后者，省事）。手不可以直接触碰膜，避免膜污染。要用镊子，感觉铁镊子比塑料的镊子更加好用（弯镊，是白师兄给的），用镊子可以夹4个角。海绵（黑色）、滤纸薄（可以不要）和滤纸厚各2张，用纯水冲洗一下，先泡在转膜液中，膜白胶黑，夹子中间的滤纸要足够多，太少转膜会发生位移，转不好。太多的话又夹不上，？还是紧一点。如果有薄的膜，黑的那面放在铁盘上（因为没有那个夹子多出来的部分，所以可以稳固地放在铁盘上），然后放海绵，接着是厚滤纸，薄滤纸，胶，膜，薄滤纸，厚滤纸，海绵，白色的那一面（三明治夹法），转膜的话我喜欢海绵靠上黑白板的连接处，之后放的时候，这个连接处朝下放进转膜液中，这样就可以？转膜液浸没胶和膜。（如果需要标记不同的膜，可以用圆珠笔在膜上没有蛋白的地方做标记，也可以在转膜架子上标记，但是因为转膜液中有？醇，很容易掉色）。→用绿色的片子轻轻固定住膜和胶，用小滚轮？膜胶之间的气泡，其他地方的气泡（滤纸与胶，滤纸与滤纸之间的都无需理会）无需理会→夹子放进去转膜槽，黑对黑，白朝红，（至于上下其实无所谓，因为是水平电流，只要转膜方向与电流方向一致即可，正极到负极，红到黑（方法是对的，但是电流是正极到负极，电子是负极到正极）

转膜方向：

胶拿下来，短玻璃板朝向自己，用绿色的片子挑开短玻璃，截掉浓缩胶的部分。用绿色的片子把胶不更改方向地滑到滤纸上即可。膜与胶中间接触的那一面是正面，用剪刀在正面的左上角剪个角作为标记，如果有很多张膜需要转，也可以用半干转的机器，这个机器需要的转膜液很少，一次性可以转膜6张，甚至更多张膜，省？实验室有，但是黄曦实验室没有。只能用湿转，一个电泳槽只能转2张膜。目前实验室只有2套可以转膜的仪器，也就是说一次性？多转膜4张。（23.4.25）

记得转膜的时候需要在冰盒里转膜，因为转膜会产生大量热量。转膜液先加一点，然后拿小冰盒放进转膜液中（加太多转膜液的话，加入冰盒会溢出），全称避免膜离开液体太久干掉。→转膜液加满，不要溢出来就好，越多越好，要浸没胶和膜的高度。铺一层冰在大泡沫盒里，挖一个洞，放上转膜槽，盖上盖子，红对红，黑对黑，在缝隙里加冰，先盖盖子再加冰，防止冰误入转膜液稀释转膜液。盖子盖好后，角落里加冰，越多越好，但是冰不要在盖子上，防止冰融化后顺着孔流进转膜液，稀释了转膜液。电流300mA，90min（省？），或100V，100min（黄曦实验室），跑小分子或者中间没时间过来处理，可以转成70V，2h（黄曦实验室，师姐说的，但是我没有试过）。设置时间为100min，跑完会自己停止的，记得检查S1的位置，确保只有一个程序在跑，不然跑完还会继续下一个程序跑。

提前配好牛奶，或者拿出来融化→关闭电源，用1×？ST洗掉转膜液（省？的话会洗3次10min，黄曦实验室是稍微涮一下），5%脱脂奶粉封闭1-2h（久一点也没事），摇床上封闭，速度小→洗掉牛奶（省？的话会洗3次10min，黄曦实验室是涮干净牛奶就好），封闭快结束的时候提前准备好一抗。

裁膜：

膜的正面要朝上，放在PE薄膜手套里，切膜（选择蛋白分子量不要太接近，有写理论上分得开，但是实际上很难，也不好看，所以？还是分隔远一点），下面点一个厚的硬纸板（不硬的不好裁膜），用尺子和小刀子裁膜，全程不要使膜干掉。

开始孵育一抗，4度过夜（摇床上，慢速，只有洗膜速度是高的，封闭和孵育抗体都是慢速，因为时间长，太快会使蛋白摇出去），16h或者更长时间。一抗空管子可以放4度→一抗回收，1×？ST洗膜3次，每次10min。提前融化好二抗，孵育二抗（记得对好一抗的种属，看看是Mouse和还是Rabbit），常温摇床上1h或者更久。

牛奶可以回收5次，放-20，记得标记“正”。一抗和二抗也可以回收5次或者更多次，保险起见还是5次，可以用到孵不出来为止，但是有点浪费前面跑胶的时间，一旦发现抗体不好用，直接丢掉，不要放着混淆了。一抗和二抗都是用5%BSA（用？ST去配制的）稀释。

抗体管子上要标记的信息：姓名，配制日期，回收次数，抗体名称，稀释倍数，产商，二抗种属（Mouse和还是Rabbit）。

显影：

？是避光。显影液A（需要避光）和B液按体积比1:1配制好，用轻的铁盘（上面有白色的部分）显影，拿走filter。手动曝光，一般刚开始使用少的秒数，慢慢增加，如果蛋白是熟悉的蛋白，就知道大概要多久，可以记下来每个蛋白的曝光时间。一般内参GAPDH和actin曝光时间很短，大概3/10s就可以。普通型发光液曝光时间长，增强型发光液曝光时间短，如果是容易曝光的，直接用普通型（比如内参，刚开始不熟悉的蛋白也直接使用普通型，摸索之后发现时间久的才用增强型）。

外泌体表征的蛋白：

1Calnexin:普通型：40-50s，增强型：15s。

2 CD63:普通型：2min30s，增强型：1min15s。

3CD9:普通型：5min30s（还是很微弱的条带，还要延长时间），增强型：2min45s。

其他蛋白：

1PD-L1:普通型：40-50s，增强型：15s。

2GAPDH：普通型：3/10s，增强型：没必要。

3actin：普通型：3/10s，增强型：没必要。

补充：

外泌体表征用到的蛋白及相关信息：一般只挑三个就可以，一个阴性指标，两个阳性指标。（小韦给的抗体）

GAPDH大小是37kDa，Actin大小是45kDa。

明师姐说CST的抗体，红盖子一般1:2000稀释，蓝盖子一般1:1000稀释。

广东省？院实？时的wb笔记（刘师姐教我的wb）