蛋白BCA定量

蛋白定量（BCA定量）

按照说明书来即可。每次的标准曲线都需要重新做，因为孵育时间并不能控制得很一致等因素会影响结果。也可以从标准曲线看出？作是否正确。不过之前在省？是直接同一个批次的试剂都是用同一个标准曲线（如果觉得自己实验？作没有问题，其实可以不用每次都做一次标准曲线）。（以后都不用做标准曲线，但是没有标准曲线需要自己算，之前已经发过相关的拟合方法）

试剂公司：弗德生物，国产

BCA定量的测定范围：20-5000μg/？

BCA定量试剂盒：试剂A 100？，试剂B 3？（Cu2+）， BSA标准品 1？，原管浓度是5mg/？，使用浓度是0.5mg/？。一般不做复孔，每个样本只需要一个孔。使用平底的96孔板。

稀释液：蛋白样本在什么溶液中稀释，标准品也用什么溶液去稀释（蛋白稀释液：PMSF+RIPA，1:99，PMSF原浓度是100mM，使用浓度是1mM）。为了方便，也可以用PBS，纯水或者生理盐水来稀释（0.9%的NaCl溶液）标准品一共8个孔，如果试剂不够，可以酌情减少孔数，6个也可以。

1提取好蛋白，稀释到待测范围内，蛋白质一般稀释20倍（1μl样本+19μl稀释液，总体积为20μl），如果是外泌体和囊泡定量，一般稀释5倍（1个超离管用200μl重悬的话，稀释5倍；用100μl重悬的话，稀释10倍。建议用100μl重悬，浓度高一点，但是缺点是液体太少，不好重悬，所以？一次性8个管子都是同种上清就好），看不到沉淀或者一点点沉淀可以用100μl重悬，沉淀很多可以考虑用200μl重悬。根据沉淀量的多少来稀释。

2按下表加样标准品，做出标准曲线：

3加入稀释后的待测样本。

4配制BCA工作液，试剂A：试剂B=50：1，每孔加入200μl BCA工作液，包括标准曲线和待测样本的孔。先加小体积后+大体积比较容易混匀（但是先加大体积，后加小体积比较容易打得干净，我个人比较喜欢先加大体积，后加小体积，因为混匀的话可以摇动板子来混匀），且不容易产生气泡。？每孔工作液体积一致即可，可以酌情减少，减少试剂使用量。

5在37℃培养箱（病毒房？专用培养箱，不要去细胞培养箱，会污染别人的细胞，也可以细胞培养箱，那个培养箱基本没人养细胞，还是用细胞培养箱，比较干净）孵育30min。也可以室温2h或者60℃ 30min。BCA定量时，吸光度会随着时间的延长不断增加，肉眼可见颜色加深。显色会随着温度的升高而加快。如果浓度比较低，适合在较高温度孵育，或者延长孵育时间。

6酶标仪检测OD值：测定A595（540-595nm之间即可），可以输入标准曲线浓度，直接导出待测样本的浓度：

上机：点开软件→九个格子的位置→输入标准品浓度，以及待测样本的位置（S1-Sn）→放板子（记得去盖子）→在有箭头的地方，设置为Step（也可以fast，差别不大），波长595nm→measure→看标准曲线R2，越接近1拟合度越好，0.9以上皆可，？0.995以上。若有点偏离标准曲线，可以删除该点的数据，继续拟合。

机器的密码是5个0，？enter即可解锁机器。Step和Fast模式并没有太大的区别，但是理论上Step会更加？，但是耗费时间相对长一些。

在电脑上我的名字下有个protocol文件，可以不用每次都输入标准曲线浓度，直接使用protocol即可。

如何一次性增加多个样本：有一个向下的箭头，然后把duplicate，即重复孔设为1个，就可以增加多个样本，而且是按照s1,s2,s3这样递增的。

补充：BCA定量试剂盒说明书

简约版：

蛋白定量（BCA定量）

BCA定量的测定范围：20-5000μg/？

BCA定量试剂盒：试剂A 100？，试剂B 3？（Cu2+）， BSA标准品 1？，原管浓度是5mg/？，使用浓度是0.5mg/？。不做复孔。

稀释液：用PBS，纯水或者生理盐水来稀释。

1按下表加样标准品，做出标准曲线：

2加入稀释后的待测样本。

3配制BCA工作液，试剂A：试剂B=50：1，每孔加入200μl BCA工作液。

4在37℃培养箱孵育30min。

5酶标仪检测OD值：测定A595。