Advanced Biology | 3D肿瘤免疫共培养新突破：揭秘CD8+ T细胞耗竭轨迹

来自上海交通大学医学院的研究团队在Advanced Biology发表的最新研究，成功开发了一种基于GelMA-PEO水凝胶的3D肿瘤-免疫共培养系统（3D-HyGTIC），首次在体外精准模拟了肿瘤微环境（TME）对CD8⁺T细胞的动态耗竭过程。这一发现突破了传统2D培养和动物模型的局限，揭示了PD-1单抗治疗后的LAG-3上调现象，并验证了“抗PD-1⁺抗LAG-3”时序联合治疗的增效机制。研究不仅为肿瘤免疫逃逸提供了全新研究工具，更为临床优化免疫检查点抑制剂（ICIs）的联合策略提供了理论依据。

研究背景

在肿瘤免疫治疗领域，CD8⁺T细胞的功能耗竭是限制治疗效果的关键障碍。随着肿瘤微环境（TME）的持续压力，CD8⁺T细胞逐渐丧失杀伤活性，表现为PD-1、LAG-3、CTLA-4等免疫检查点分子的上调，最终导致免疫逃逸。尽管PD-1/PD-L1抑制剂在临床取得显著成效，但多数患者仍面临原发或继发性耐药问题，尤其是替代性抑制通路（如LAG-3）的激活，使得单一疗法效果受限。传统研究方法主要依赖二维（2D）细胞培养或小鼠移植瘤模型，但前者无法模拟TME的空间异质性，后者则存在实验周期长、成本高、与人类免疫系统差异大等局限。近年来，3D培养技术（如类器官、微流控芯片）虽部分重现了肿瘤-免疫相互作用，但天然基质（如Matrigel）存在批次差异，而合成材料（如聚乙二醇PEG）可能引发非特异性免疫反应，难以精确解析T细胞耗竭的动态演变过程。甲基丙烯酰化明胶（GelMA）因其优异的生物相容性和可调机械性能，已被广泛应用于组织工程领域，但其在模拟TME诱导的免疫耗竭中的作用尚未明确。研究团队基于GelMA与聚环氧乙烷（PEO），开发了一种新型3D水凝胶微球系统（3D-HyGTIC），首次在体外重现了TME中CD8⁺ T细胞的动态耗竭轨迹，并揭示了PD-1阻断后LAG-3上调的潜在耐药机制，为优化免疫联合治疗策略提供了新思路。

主要结果

1. 3D-HyGTIC系统的生物相容性与稳定性验证

为了评估GelMA-PEO水凝胶微球对肿瘤细胞和免疫细胞的兼容性，研究采用Calcein-AM/7-AAD活死染色结合长期培养实验（14天）。结果显示，LLC、MC38和B16肿瘤细胞在微球内增殖良好，存活率>95%，且紫外光交联（10s，365nm）未引起显著DNA损伤（γ-H2AX检测）。免疫细胞共培养96小时内，CD4⁺/CD8⁺T细胞比例及细胞因子（IFN-γ、IL-2、TNF-α）分泌水平与空白对照组无差异（图1），证实该系统无免疫原性干扰。

图1.GelMA-PEO相分离剂的制备与鉴定

2. 肿瘤微环境诱导的CD8⁺ T细胞耗竭动态

为解析TME中CD8⁺T细胞的功能演变，研究通过流式细胞术纵向监测微球内/外免疫细胞表型。发现浸润至微球内部的CD8⁺ T细胞（INNER）在48小时内PD-1、LAG-3、CTLA-4表达逐步上调，同时效应细胞因子（IFN-γ、TNF-α）分泌减少，而调节性因子IL-10增加（图2、3）。这一耗竭轨迹与小鼠体内肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的动态高度一致，证实3D-HyGTIC可精准模拟TME的选择压力。

图2. 3D-HyGTIC系统中浸润免疫细胞的动态变化揭示CD8⁺ T细胞功能随互作时间递减

图3. 3D-HyGTIC系统重现体内肿瘤微环境中浸润CD8⁺ T细胞的免疫检查点动态表达

3. 抗PD-1治疗的时效性效应与LAG-3耐药机制

为优化免疫检查点阻断策略，研究在3D-HyGTIC中分别于24h/48h添加抗PD-1抗体（1-50μg/mL）。早期干预（24h）显著恢复CD8⁺ T细胞的TCF-1⁺干细胞特性和细胞毒性（IFN-γ↑3.2倍），而延迟治疗（48h）仅部分逆转耗竭，且伴随LAG-3的补偿性上调。临床样本分析进一步显示，非响应患者（NR）外周血CD8⁺ T细胞在抗PD-1治疗后LAG-3表达增加，与体外结果相互印证（图4）。

图4. 3D-HyGTIC系统中抗PD-1治疗在早期时间点显著恢复CD8⁺ T细胞功能

4. 时序联合治疗策略的增效验证

基于LAG-3的耐药机制，研究设计"抗PD-1（48h）→抗LAG-3（72h）"的序贯治疗方案。与单药相比，联合治疗使肿瘤细胞凋亡率提高2.1倍，并显著增强CD8⁺ T细胞的增殖（CFSE指数↑1.8倍）和效应功能（IL-2↑2.3倍）（图5）。患者来源肿瘤片段（PDTF）共培养实验证实该策略可突破PD-1单药耐药。

图5. 3D-HyGTIC系统中抗PD-1治疗诱导CD8⁺ T细胞LAG-3表达上调及其临床相关性

结论

本研究通过构建3D-HyGTIC系统，结合体外共培养模型与体内移植瘤实验，系统解析了肿瘤微环境（TME）中CD8⁺ T细胞的动态耗竭机制及免疫治疗响应规律。研究发现，GelMA-PEO水凝胶微球可精准模拟TME的时空异质性，重现CD8⁺ T细胞在肿瘤浸润过程中PD-1、LAG-3、CTLA-4等免疫检查点的渐进性上调（24-96小时），并伴随效应功能（IFN-γ、TNF-α）的逐步丧失。抗PD-1治疗的时效性分析揭示，早期干预（24小时）能显著恢复TCF-1⁺干细胞样特性及细胞毒性，而延迟治疗（48小时）则因LAG-3补偿性上调导致疗效受限。这一现象在临床非响应患者（NR）的外周血及公共数据库中得到验证。通过"抗PD-1→抗LAG-3"的序贯联合策略，成功突破单药耐药，使肿瘤细胞凋亡率提升2.1倍，CD8⁺ T细胞增殖与功能显著增强。本研究首次证实3D-HyGTIC系统可作为TME诱导免疫耗竭的可靠体外模型，其预测性已通过患者来源肿瘤片段（PDTF）共培养实验得到验证。研究成果不仅阐明了免疫检查点阻断的时效性规律，更为临床优化联合治疗方案（如PD-1/LAG-3序贯给药）提供了直接实验依据。这种仿生材料与免疫调控相结合的研究范式，为开发新一代个体化肿瘤免疫治疗策略开辟了新途径。

期刊介绍

Advanced Biology是Wiley出版社旗下Advanced 系列期刊之一。Advanced系列是Wiley倾力打造的自主旗舰品牌，涵盖了各学科领域的优秀期刊，如综合类期刊Advanced Science（IF: 14.1） 和材料科学期刊Advanced Materials (IF:26.8)等。作为Advanced系列的第一本生命科学类期刊，Advanced Biology （IF:2.6）创刊于2017年，旨在成为生命科学领域具有国际影响力的原创成果发表平台，涵盖从分子到整个生命体以及更高尺度的生命科学研究。期刊致力于报道重要新颖具有广泛生物学意义的基础及应用研究，包括但不限于以下领域：细胞与分子生物学、系统生物学、合成生物学、组织工程与再生医药、生物技术与生物工程、免疫学、微生物学、结构生物学、神经生物学、癌症研究、发育生物学、遗传学与表观遗传学、生态系统与进化生物学等。作为Hybrid期刊，Advanced Biology为作者提供Gold Open Access发表选项。