Advanced Biology | 免疫细胞冷冻保存新突破：告别DMSO，迎接高效低毒新时代

来自郑州大学的研究团队在Advanced Biology发表的最新研究综述了免疫细胞冷冻保存的进展与挑战，揭示了该技术在过继细胞免疫治疗中的核心瓶颈：冷冻过程中冰形成引发的机械与渗透损伤、DMSO等冷冻保护剂的毒性，以及细胞膜改变、蛋白变性等生化损伤共同导致细胞功能受损。这一总结挑战了传统依赖高毒性DMSO的冷冻策略，首次系统阐明不同免疫细胞（T细胞、NK细胞、DC细胞等）的差异化冷冻特性，为优化冷冻方案提供了细胞特异性依据。研究不仅为理解低温环境下免疫细胞的损伤机制提供了新视角，还为开发生物相容性冷冻保护剂、标准化冻融方案及功能修复策略奠定了理论基础，对推动“现成”免疫细胞治疗产品的临床转化具有重要意义。

研究背景

在过继细胞免疫疗法中，免疫细胞的长期有效保存是实现临床转化的核心瓶颈。T细胞、NK细胞、DC细胞等免疫细胞作为“活药物”，其制备与临床应用往往存在时空差异，需通过冷冻保存桥接这一间隙。然而，当前冷冻保存技术面临多重挑战：冷冻保护材料（如 DMSO）生物相容性差，不仅会损伤细胞的分子与亚细胞结构（如引发线粒体功能障碍、DNA甲基化异常），还可能导致患者过敏、肾损伤等不良反应；冷冻过程中冰形成引发的机械与渗透损伤，以及细胞膜改变、蛋白变性等生化损伤，进一步降低解冻后细胞的活性与功能；不同类型免疫细胞的冷冻特性差异显著（如NK细胞对冷冻更敏感，DC细胞的分化阶段影响冷冻效果），现有方案难以实现精准适配。

传统冷冻策略长期依赖高浓度 DMSO，虽能在一定程度上保护细胞，但毒性问题和标准化缺失（如冷却速率、储存条件不统一）严重制约了现成免疫细胞治疗产品的普及。尽管抗冻蛋白、纳米材料等替代保护剂被尝试开发，但其对免疫细胞的保护效能及机制尚未系统阐明。因此，深入探究免疫细胞冷冻损伤的分子机制，解析不同细胞类型的冷冻特性，成为突破现有技术瓶颈、推动免疫细胞疗法广泛应用的关键。

主要结果

1. 免疫细胞冷冻保存的主要损伤机制

免疫细胞冷冻保存的损伤机制主要涉及冰形成相关损伤、冷冻保护剂（CPAs）毒性及其他生化损伤（图1C）。冰形成过程中，冷却速率过高会导致细胞内结冰引发机械损伤，速率过低则因细胞脱水引发渗透损伤（图1D），Mazur提出的双因素理论指出存在细胞特异性的最优冷却速率，但多数免疫细胞的最优速率仍不明确，目前常用的-1℃/min 慢速冷冻缺乏系统验证（图2）。解冻时冰重结晶同样造成损伤，而抗冻蛋白（AFPs）及其模拟物可通过结合冰晶抑制重结晶，外部物理场（如磁场、激光）的均匀快速复温也能减轻此类损伤。

图1 免疫细胞制品的低温保存制备

图2 缓慢冻结步骤示意图和冰致冷冻损伤机制

2. 冷冻保护剂（CPAs）的毒性及替代探索

CPAs 的毒性以二甲基亚砜（DMSO）最为典型，其会导致细胞分子层面（组蛋白乙酰化、DNA 甲基化）、亚细胞层面（线粒体功能障碍、膜脂质改变）的损伤，并引发患者过敏、肾损伤等不良反应（图3）。尽管DMSO因高效胞内保护仍被广泛使用，但降低或替代DMSO成为研究重点，如海藻糖与DMSO联用可降低其浓度，而小分子（甜菜碱）、纳米材料（氧化石墨烯）等替代物的效果仍需针对免疫细胞进一步验证。

图3 DMSO引发的毒性损伤

3. 冷冻过程中的其他生化损伤

除冰形成和CPAs毒性外，免疫细胞还会遭受其他生化损伤，包括细胞膜结构改变（脂质成分变化、相变）、蛋白质变性（低温下多肽解折叠）及氧化应激（活性氧 ROS 积累）（图4）。低温导致细胞膜流动性下降、胆固醇含量增加以增强疏水性；蛋白质因 hydration 状态改变而变性；受损线粒体产生的ROS进一步破坏核酸和脂质，而胎牛血清（FBS）中的转铁蛋白可通过结合铁离子抑制 ROS 生成，常被用于缓解此类损伤。

图4 冷冻保存过程中的其他生化损伤

4. 免疫细胞冷冻保存的研究进展与挑战

免疫细胞冷冻保存是过继细胞免疫治疗的关键技术，但其面临冷冻损伤、保护剂毒性等挑战。冷冻损伤包括冰形成引发的机械与渗透损伤（图1C、D）、DMSO 等冷冻保护剂的毒性（图3），以及细胞膜改变、蛋白变性、氧化应激等生化损伤（图4）。不同免疫细胞冷冻进展各异：T 细胞（含 CAR-T）多依赖5%-10% DMSO，部分功能下降；NK 细胞对冷冻敏感，解冻后活性降低；DC 细胞冷冻中，单核细胞冷冻后分化的 DC功能更优。现存挑战包括：DMSO毒性及 FBS/HSA 批次差异，冻融方案无标准，功能评估忽视体内及延迟死亡。未来需开发生物相容性保护剂（图5）、优化冻融方案、修复解冻后功能（图6）。

图5 基于自然启发的生物相容性冷冻保护剂探索

图6 免疫细胞低温保存技术展望

结论

本研究综述了免疫细胞冷冻保存的最新进展与挑战，指出其作为过继细胞免疫治疗关键技术，面临冷冻保护剂生物相容性差、效率低及解冻后功能受损等问题。冷冻损伤包括冰形成相关的机械与渗透损伤、DMSO等保护剂的毒性及细胞膜改变、蛋白变性等生化损伤；不同免疫细胞冷冻表现各异，T细胞依赖5%-10% DMSO但部分功能下降，NK细胞对冷冻敏感，DC细胞中单核细胞冷冻后分化的细胞功能更优。当前挑战集中在保护剂毒性、冻融方案标准化及功能评估局限，未来需开发生物相容性保护剂、优化冻融方案及修复解冻后功能，以推动临床转化。

期刊介绍

Advanced Biology是Wiley出版社旗下Advanced 系列期刊之一。Advanced系列是Wiley倾力打造的自主旗舰品牌，涵盖了各学科领域的优秀期刊，如综合类期刊Advanced Science（IF: 14.1） 和材料科学期刊Advanced Materials (IF:26.8)等。作为Advanced系列的第一本生命科学类期刊，Advanced Biology （IF:2.6）创刊于2017年，旨在成为生命科学领域具有国际影响力的原创成果发表平台，涵盖从分子到整个生命体以及更高尺度的生命科学研究。期刊致力于报道重要新颖具有广泛生物学意义的基础及应用研究，包括但不限于以下领域：细胞与分子生物学、系统生物学、合成生物学、组织工程与再生医药、生物技术与生物工程、免疫学、微生物学、结构生物学、神经生物学、癌症研究、发育生物学、遗传学与表观遗传学、生态系统与进化生物学等。作为Hybrid期刊，Advanced Biology为作者提供Gold Open Access发表选项。