基因编辑敲入（KI）技术三种方法介绍

基因敲入：在基因组特定位点精准插入外源序列，如报告基因、外源蛋白、功能片段等，实现对基因的精准编辑。

相关技术方法包括HDR、CRISPaint、HES-KI等。

HDR （Homology-Directed Repair，同源重组修复）

是 CRISPR-Cas9 基因编辑技术中的一种精准基因插入策略，其核心原理如下：

通过 sgRNA 引导 Cas9 核酸酶在目标基因组位点切割 DNA 双链，诱导产生 DNA 双链断裂（DSB）。而后细胞启动HDR机制，此时需提供一段与目标位点上下游高度同源的 DNA 模板（Donor DNA）。HDR 以该模板为蓝本，通过同源重组将外源基因片段精准插入基因组。

特点：由于 HDR 依赖于细胞周期 S/G2 期的同源重组机制，具有高精准度，但效率较低，适用于分裂活跃的细胞。

CRISPaint（CRISPR-based Precision Assisted Integration via MMEJ）

是一种基于CRISPR-Cas9系统、利用微同源末端连接（MMEJ）机制实现大片段DNA精准插入的创新基因编辑技术，克服了传统同源重组（HDR）对长同源臂和细胞分裂周期的限制。

该技术通过 sgRNA 引导 Cas9 在目标位点切割 DNA，产生 DSB，激活细胞内的 DNA 修复机制。

与传统 HDR 依赖长同源模板不同，CRISPaint 利用细胞自身的微同源介导末端连接（MMEJ） 修复通路，通过以下步骤实现插入：

在 DSB 位点，Cas9 切割后暴露的 DNA 末端被细胞识别为 “损伤”；

外源供体 DNA（线性或环状）被递送至细胞，其两端携带与目标位点部分互补的短同源臂（通常 20-50 bp）；

MMEJ 修复过程中，供体 DNA 的短同源臂与 DSB 末端的微同源序列配对，进而将供体 DNA 精准连接至目标位点，实现数千碱基的大片段插入，无需 HDR 所需的长同源模板。

特点：不依赖细胞周期 S/G2 期（因 MMEJ 通路可在各周期发挥作用），编辑效率高于 HDR；可实现外源基因的稳定高表达，但由于 MMEJ 过程中可能伴随末端修剪或随机碱基添加，可能引入 Indel，需通过筛选获得精准插入的细胞克隆。

HES-KI

HES-KI（重要基因位点敲入）是一种新型的敲入技术，通过在重要基因的C端外显子区域进行CRISPR编辑，并设计一个转基因敲入模板，使得成功敲入的细胞能够恢复重要基因的功能，同时整合敲入的基因序列；如果未成功敲入细胞，如NHEJ介导的有插入或缺失（indels）的细胞，将导致重要基因功能丧失，使细胞无法存活，从而实现对成功敲入细胞的富集。

这种“存活即成功”的正向筛选机制自然富集了敲入成功的细胞，无需额外抗性筛选。

这种“存活即成功”的正向筛选机制自然富集了敲入成功的细胞，无需额外抗性筛选。

HES-KI 技术优势

超高效率：通过正向筛选机制，HES-KI在多种细胞系（如K562、293T、CHO-K1）中实现40%-90%的敲入效率，显著高于传统HDR（通常5-30%）。

表达稳定且均一：敲入单克隆细胞中目的基因表达稳定，传代15代后仍保持高均一性，适合工业化生产（如CAR-T细胞疗法）。

多基因整合能力：可一次性敲入多个基因（如GFP+mCherry），或大片段（如5.2kb），减少多次编辑步骤，降低脱靶风险。

灵活调控表达水平：通过选择不同必需基因（如强表达GAPDH vs. 弱表达TBP），可精细调节目的基因的表达强度，满足不同研究需求。

兼容多种递送系统：支持质粒、AAV、RNP等多种Cas9/sgRNA和供体DNA递送方式，适配不同细胞类型（如iPSC、原代细胞）。

应用场景

基因治疗：在K562细胞中敲入EGFP，未筛选时多克隆效率达37%，单克隆表达稳定且不影响细胞增殖。

工业生产：293T和CHO-K1细胞中EGFP敲入效率分别达68%和55%，满足抗体/蛋白生产的均一性要求。

干细胞工程：iPSC中同时敲入GFP和mCherry，或5.2kb大片段，流式检测阳性率超98%，为再生医学提供可靠工具。

疾病建模：构建高纯度基因修饰细胞系，精准模拟肿瘤或遗传病突变，助力药物筛选