细胞划痕实验(Wound Healing Assay)

细胞划痕实验(Wound Healing Assay)是一种细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动，经常被用于研究细胞迁移和修复能力的经典体外模型。其操作简单、成本低且能模拟体内伤口愈合过程，也常用于肿瘤生物学、再生医学以及药物筛选等领域。

其原理为在融合的单层细胞上认为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合。细胞迁移过程中，在开始和定期捕获图像，通过测量不同时间点 的划痕间距并计算差值，可对细胞的迁移能力做出判断。

1. 细胞划痕实验步骤: 

(1) 划线: 用六孔板底面，马克笔，顺直尺画三条横线作为标记线；

(2) 种板: 根据分组种板，细胞密度为5×10⁵个/孔左右，并务必铺匀；

(3) 划痕: 待细胞长满后，用直尺比着，100μL枪头垂直于孔板和画的标记线划两条垂线，使划痕与标记线相交，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点；推荐使用100μL枪头(适用于大多数细胞)，或200μL枪头(需更用力控制)。

(4) 清洗: 弃去旧培养基，沿培养板壁缓慢加入无菌DPBS，轻柔冲洗3次，彻底去除划痕产生的细胞碎片；

(5) 加液: 根据分组分别加入加药培养基或无血清培养基；

• 对照组: 加入无血清培养基。
• 实验组: 加入含药物或基因干预的无血清培养基。
• 避坑提示: 避免使用吸泵抽吸液体，防止机械力破坏细胞单层。

(6) 拍照观察: 划痕、清洗、加液完成后，用显微镜拍不同倍数的照片，作为0h对照。放入37℃，5％CO2培养箱中培养。在所需时间点取出细胞，于显微镜下观察同一位置划痕宽度并拍照(下面举例说明)；

• 时间点选择:

1. 快速迁移细胞(如MDA-MB-231): 0、6、12、24h；
2. 慢速迁移细胞(如成纤维细胞): 0、12、24、48h。

• 拍照规范: 

1. 使用4×或10×物镜，确保划痕居中且垂直；
2. 同一位置拍摄时，在实验记录本上标记坐标，避免位置偏移。

(7) 数据分析: 一种是统计细胞迁移的距离，一种是统计划痕面积，都可以用ImageJ软件来进行分析，这个软件在后台有，只需后台回复“科研软件”，再回复“相对应的代码”即可获取。

值得注意的是，并不是所有的细胞都适合划痕实验，例如: 乳腺癌细胞系MCF-7几乎不具备迁移能力，而MDA-MB-231具有较强的迁移性。因此，在选择细胞时需要考虑细胞自身的迁移能力和对无血清环境的适应性；在无血清培养环境下，一些肿瘤细胞系在12小时内细胞凋亡率就会超过50%。所以，划痕实验并不适用于所有肿瘤细胞系。

2. 细胞划痕数据分析：

在数据分析这里，常用的方法有两种: 划痕面积计算和宽度变化分析(适用于不规则划痕分析)。这里我们常用的分析软件为ImageJ，文章前面提到过，要想获得这软件，后台回复“科研软件”，再回复“相对应的代码”即可获取。

(1) 划痕面积计算

• 导入图像: 打开ImageJ，选择“File → Open”导入时间序列图像；