细胞基因敲除效率低怎么办？

基因敲除：通过同源重组等方法，将细胞或生物体基因组中的目标基因进行删除或破坏，使该基因无法正常表达。

细胞基因敲除是一个漫长的实验过程，前期的sgRNA设计、载体构建、细胞培养、慢病毒包装、细胞转染/转导等多个流程，每个流程都会影响到敲除结果。

以下是几个在实验过程中总结出的实验室Q&A--

Q：sgRNA设计怎样避免脱靶？

A：首先靶位点尽量处于前1/3的编码区，其次CG含量为40%~60%，同时避免连续4个以上相同碱基，最后尽量选择特异性评分高的sgRNA。

脱靶效应：指 CRISPR 系统在非目标位点进行切割的现象，可能导致意外基因突变，是基因编辑的主要安全隐患。

Q：载体构建一般用什么载体？

A：一般选择慢病毒载体，配合两个表达病毒酶和病毒外壳的辅助载体，共转染到HEK293T细胞中，以此来产生完整的慢病毒。

载体构建：将目的基因或调控元件插入载体 DNA 的分子克隆过程，是基因编辑实验的关键前期准备。

Q：可以不使用慢病毒转导吗？

A：除了慢病毒转导以外，还有电转、化学转染，通过摸索电转条件或转染试剂比例，达到转染效果。

Q：有没有快速高效的转染方法？

A：质粒或者慢病毒转染/转导细胞，质粒进入细胞还需要一定的时间来表达Cas9蛋白，表达出的Cas9蛋白再对目的基因进行切割，可以一开始就将Cas9蛋白与sgRNA通过电转递送到细胞中，缩短切割时间。

Q：电转对细胞有一定的刺激，有没有其他方法递送sgRNA与Cas9蛋白？

A：CRISPR KO极速敲除试剂盒，里面包含sgRNA、Cas9蛋白和生物分子递送载体，不需要电转，直接加入细胞中孵育，6h后检测到目的基因切割，48h后完成基因敲除。

Q：Cas9蛋白与sgRNA转染进细胞，就一定能敲除基因吗？

A：Cas9蛋白与sgRNA转进细胞，也有脱靶的可能，可以添加多条sgRNA降低脱靶效率。

随着递送技术与 sgRNA 设计算法的持续优化，基因编辑正朝着更精准、更高效的方向发展。未来，这类极速敲除系统有望在基因治疗临床转化中发挥关键作用，为单基因遗传病等难治性疾病带来新的治疗希望。