共聚焦实验如何看

6个激光器：405nm、458nm、488nm、514nm、543nm、633nm。

和3个发射光检测器：检测范围为360nm~710nm。

开机顺序：1→2→电脑主机→扫码上机→卤化物灯→3。

1first打开电动载物台电源

2打开这个，前面开关要打开，后面有个黄色按钮也要按下去。

3按照顺序来按这个，先1后2。 

4电脑主机，然后扫码上机。开卤化物灯。开机之后至少使用半个小时以上。关机之后要等待半个小时后才可以开机使用。如果用完，发现下一个人来了，直接什么都不用关，直接下机，然后下一个人直接扫码上机就可以。

1是总开关，2是显微镜和电脑的开关。如果2号不开是没有办法扫码上机的，3号是激光器。卤化物灯是镜下观察使用的，然后激光器是电脑预览和拍照用的。

5电脑开机的界面，选择user，其他开关都正常开始之后，确保电脑和显微镜都打开的情况下，打开3号。软件是桌面上灰色的zen，蓝色的是分析软件。click start system。

灰色的ZEN是仪器软件。

6触碰屏幕一打开是在Home那里的，click microscope，物镜有2个10倍，2个20，2个40油镜，和1个63倍的油镜。2个不同之处在于first10倍和20倍是看共聚焦皿或者玻片，后面一个的话是看孔板的，看孔板的话还要加一个黑色框框（适配器）。孔板是不能用油镜的，40倍的一个是可以用油镜，一个是不可以用油镜的。（油镜有显示oil）。油镜是用棕色的瓶子里的油滴在物镜上进行观察，缩小两个固定器的距离是用共聚焦皿，拉开的话是用来观察玻片的。然后放置样本的时候可以直接放进去，也可以把载物台的这个东西往后推，但是注意着力点只能是中间的部位，不可以推两边的位置。

触碰屏

以上这个位置可以上下左右调节载物台的位置。

只能推中间的部分。

7第二个事是滤光块，126是明场，绿色荧光，红色荧光和DAPI，可以在触碰屏下切换，也可以在电脑上进行切换，如果用触碰屏的话，clickGFP之后，同时还要click把RL打开。如果看的是明场的话，需要进行切换（click一个触碰屏上的地方），把RL关掉， 把TL打开。如果觉得有点绕，直接在电脑上的locate进行设置，设置好之后触碰屏上也会跟着进行更改，电脑就是可以operate触碰屏的，看的时候需要关灯。

8有时候调焦距的时候，会显示minor已经到z的地方了，显示焦距已经调到底了，需要把细准焦螺旋或者粗准焦螺旋往反方向进行调节焦距。

9开机，然后镜下找视野，然后在电脑上选择荧光，然后调节荧光亮度，调拍照参数，然后拍照。

选择通道的时候，选择ac?uisition，然后是smart setup，在坐上角，然后会跳出一个窗口，然后开始选择染料，选择DAPI，然后绿色的是488，先选择DAPI之后没有颜色是正常的，在选择绿色之后，就会匹配上颜色。

然后选择best singal，在中间的位置，然后apply，然后等待激光器预热，这一步就是打开激光器，之前的operation都是只打开了卤化物灯。等5分钟，?终要看红色的那一团消失才算成功。具体剩余的时间可以在laser properties中看，click它就可以看到。但是以红色的部分消失为准。

大概这种亮度和分辨率就可以。

10使用油镜的话，细胞best是贴壁的会比较好看一点。

11数据的拷贝在D盘，D盘有分析的蓝色软件，可以从里面复制过去，但是记得不要是剪切。跟其他仪器一样，都是要在仪器开机的时候才可以拷贝数据。

12调节激光的亮度。大的步骤就是开机，找视野，选荧光（也就是开激光器预热），调激光器的参数，调拍照参数，然后是拍照。

选择channels，一个一个调，调节除了选择前面的打钩，还需要把鼠标click在那个要调节的颜色上面。first个参数的lasers，也就是激光的强度，强度越强发出来的荧光分子越多，视野就越亮，但是越容易淬灭。

gain是检测器的电压，越大，亮度越大，但是是整个视野的亮度一起增大，也意味着噪点会up。

pinhole是针孔值，可以控制Z轴的分辨率，可以层扫，跟??一样，这个值越小，z轴更加??，但是越小的话，透过的光越少，视野也越暗。做共定位的时候需要调节这个参数，调节成1AU，所有channels拍到同一厚度。不是pinhole一样大，就在用一个层面上（因为还与其他参数相关，还跟波长等其他参数有关），要共定位的话，所有的颜色都需要调成1AU。如果不需要共定位，就直接默认的90.2就可以。如果不需要共定位调成1AU，视野会变暗的。

13 勾中一个颜色，然后鼠标也要click这个颜色，然后clicklive看一下实时是怎么样的，边看变调节，?惯先调节gain，如果gain值调到噪点比较高了，再调节laser，再调焦距，对到?亮的面。下面的图背景有点脏，原因是皿脏了。

如果对亮度没什么把握，可以选择下放到range indicator，红色是过曝的信号，蓝色是没有信号，在仪器电脑上看的话稍微过曝就是比较合适的。回去自己的电脑上看就大概是刚刚好合适的亮度，因为仪器上的分辨率会比较高，在自己电脑上的分辨率就会稍微低一些。然后stop，换其他的颜色。调节的时候可以用鼠标调节。其他颜色调完也是要stop。

14然后是调节拍照参数，在ac?uisition mode，first是调节像素点，frame size，越大分辨率越高，但是拍照时间越长，也可以直接选择optimal。

第二个参数是speed，速度越快，拍照的分辨率就越低。慢的话担心淬灭。会有和scan time，如果时间太长，就把速度调高一点。

下面的number是指拍照的张数，会把所有的照片求一个平均值，?后得到一张图。作用是降噪，一闪一闪的噪点。过滤掉非特异性的点，如果非特异性的点比较少，可以把这个number调小一点。direction选择双向扫描，可以节省一半的时间。

结合scan time，2min30s可以接受，后clicksnap，2D那里是一个叠加的图，splitt是单通道的，拍照进度条在界面的?下面。

拍完之后，中间有个diaplay，把蓝色软件拷回去也可以在这里调节和分析。有个曲线，可以调节颜色，颜色与对角线颜色一致，然后左边往右边拉是降背景，使暗的更暗。右边的往左边拉是增加亮度，使亮的更亮。

也可以使用层扫模式和拼图模式，拼图模式要选择overlap区域在1-2%，1.5%可以。这样可以使图片的连接处更加平滑，不会很突兀，之后还可以在一个地方选择smooth，进行平滑operation。然后这是以选中区域为中间，往外拍几张照（自己设定的），然后拼接在一起。区域的大小可以自己调节。

15拍完关机，共聚焦仪器的关机顺序：先把激光器关掉，所有的laser都点成off的状态，然后手动计时5min→清洁油镜，酒精（是无水乙醇还是75%乙醇）倒在擦镜纸上，擦拭物镜，一共重复2次这样的operation。这个时间可以去拷贝完数据，拷完回来一般五分钟就结束了，然后把电脑关掉→关卤化物灯，接着扫码下机（一定要这个时候扫码下机，如果把其他关掉之后就再也不能扫码下机了，会一直产生费用）。接着是按照3-2-1的顺序关闭开关，然后是关闭放在地上的那台仪器，如果是关机的话只需要把那个开关打下来，开机的时候除了把开关打上来，还需要把后面的那个黄色的按钮按一下，按进去。

文章中共聚焦实验的operation：

一、

(D)Representative confocal images showing that red fluorescence dye PKH26 labelled exosomes were endocytosed by HUVECs, H9C2s, and cardiac fibroblasts after 2 and 12 h incubation.

一、两者的应用不同：

1、DAPI的应用：可以用于活细胞和固定细胞的染色。

2、hoechst的应用：主要用于活细胞标记。

二、两者的特点不同：

1、DAPI的特点：当DAPI与双股DNA结合时,在荧光显微镜观察下，DAPI染剂在358nm(紫外线)处有一个largest吸收峰，并在461nm(蓝)处有一个largest发射峰，其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色，因此在荧光显微技术中DAPI被紫外线照亮且被蓝或青色滤镜检出。

2、hoechst的特点：Hoechst染料的荧光强度随着溶液pH升高而增强。

三、两者的概述不同：

1、DAPI的概述：DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。

2、hoechst的概述：Hoechst染料溶于水和有机溶剂，如二jia基jia酰胺或二jia基亚砜。浓度可高达10mg/mL.水溶液可在4 °C避光保存至少6个月。长期储存于≤-20 °C。

1、每个染料有自己独特的激发谱线和发射谱线.这也是以上两个染料的主要区别. 另外Hoechest 33258 是膜透性的，因此在活细胞时候能轻松进入；DAPI是半透性的，有选择性的进入。

因此Hoechest 33258 一般用来染活细胞，可以长驱直入；DAPI一般是染固定细胞。

2、两者都可以用紫外看，参见以下的激发发射波长

Hoechst 33258的largest激发波长为346nm，largest发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，largest激发波长为352nm，largest发射波长为461nm。

DAPI的largest激发波长为340nm，largest发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后，largest激发波长为364nm，largest发射波长为454nm。

二、

共聚焦皿添加培养基的体积大概是2-3mL。

共聚焦皿的参数