三个方法判断qPCR数据能不能用？
看完这篇，再也不怕被导师追着问“数据怎么又废了？”
一、扩增曲线：S型才是真命天子！
✅ 合格标准：
• 曲线像顺滑的滑雪道（S型），指数期陡峭，平台期平稳。
• 荧光值至少>3，无锯齿或二次抬头。
❌ 异常预警：
• 锯齿状：移液手抖/仪器信号不稳，用多通道移液器+检查仪器。
• 平台期过早：模板浓度过高（>100 ng/μL），稀释10倍再测！
• 无曲线：RNA降解/引物失效，换一批试剂重新提RNA。
二、阈值线：位置决定CT值命运！
✨ 设置秘诀：
• 默认选基线标准差的10倍，手动调整时要卡在指数期中间段（像切蛋糕切到奶油层）。
• 太高会漏掉低表达基因，太低易被背景干扰。
⚠️ 新手误区：别跟风调阈值！先看所有样本的曲线走势再决定。
三、CT值：15-35是安全区！
🔍 数值密码：
• 目标基因：15-35个循环（低表达基因可放宽到38，但需谨慎）。
• 内参基因（如GAPDH）：18-28个循环，且不同样本间波动≤1个循环。
🚫 雷区警告：
• CT>35：信号太弱，加模板量或优化引物。
• CT<15：模板过量，稀释后重测！
四、内参基因：稳住数据的定海神针！
🔄 选择原则：
• 选稳定表达的看家基因（如β-actin、18S rRNA），避开应激相关基因。
• 所有样本的内参CT值CV<5%（技术重复），组间波动≤1个循环。
❓ Q&A：内参CT值飘了怎么办？
• 先查RNA质量（OD260/280=1.8-2.0），再检查反转录效率。
五、重复性：数据 reproducible 才是王道！
🔄 技术重复：
• 同一样本测3次，CT值差异≤0.5，定量结果CV<10%。
• 用**Excel公式=STDEV.P(CT值)**算标准差，＞0.5就重做！
🔄 生物重复：
• 组内样本CT值分布集中，用GraphPad画箱线图，异常值（Z-score＞2）直接剔除。
六、溶解曲线：单峰才是真·专一！
🔥 黄金标准：
• 熔解峰尖锐单一，Tm值75-90℃（比引物二聚体高5-10℃）。
• 无杂峰（二聚体峰在70-80℃，需优化引物
