实验Protocol|肿瘤耐药细胞系建立-卵巢癌为例（Bio-protocol4310）

背景知识

化疗耐药是指癌细胞能够逃避或忍受治疗干预，是肿瘤研究中的一个重大挑战，与癌症复发、扩散及患者死亡密切相关。

实验目的

建立合适的药物耐药细胞模型，以模拟临床场景中癌细胞逐渐获得耐药性的过程，从而深入了解与化疗耐药调控相关的信号级联反应，并识别关键耐药分子。

实验材料

细胞系：使用 A2780细胞系。

实验方法

药物处理：采用改良脉冲法，对细胞进行紫杉醇逐步递增剂量处理，周期长达六个月，以建立耐药细胞模型。

细胞活性检测：在不同阶段使用 MTT 测定法评估细胞对药物的敏感性，计算耐药指数（RI=耐药细胞的 IC50 值 / 对照细胞的 IC50 值）。

细胞周期分析：通过流式细胞术检测细胞周期变化。

实验步骤

1. 根据每种细胞系的增殖速率，在10cm培养皿中接种100万个A2780细胞。

2. 接种后24小时，用60 nM紫杉醇处理细胞2小时，然后用4 mL新鲜培养基替换。首次治疗选择这些精确药物浓度是基于每种细胞系72小时的个体半数抑制浓度（IC50）计算得出。

3. 药物处理后，会观察到大量细胞死亡，随后在几天内逐渐形成单个菌落。由于A2780细胞体积较小，形成足够数量的大菌落需要5-6天才能达到60%-70%的汇合度。

4. 用胰蛋白酶处理并重新接种约100万个细胞到10cm培养皿中进行第2次治疗周期。为模拟临床情况，避免挑选可能具有不同分子特征和耐药指数的单克隆。

5. 再次用相同剂量的紫杉醇处理2小时，然后添加新鲜培养基，让细胞生长至60%-70%汇合度。

6. 接下来，用胰蛋白酶处理并重新接种约100万个细胞进行第3次相同剂量的治疗周期，让它们在新鲜培养基中生长。一般从第3次治疗周期开始，A2780细胞显示出均匀的生长模式。

7. 当细胞达到60%-70%汇合度时，用胰蛋白酶处理细胞，并冷冻保存其中的50%以备将来使用。将剩余的细胞按照表1中提到的递增剂量重新接种进行下一次治疗。

表格 1：A2780细胞紫杉醇耐药模型各治疗周期使用的紫杉醇浓度（单位：nM）。

8. 在此步骤中，接种部分细胞进行 MTT 检测，比较相应的敏感细胞（A2780细胞）的药物敏感性。

9. 对于 MTT 检测，将细胞以每孔 3,000 个细胞的密度接种于 96 孔板中，总体积不超过 100 微升。

10. 用一系列药物浓度处理细胞，并将培养板在 37°C、5% CO2 的培养箱中孵育 72 小时。

11. 孵育结束后，向每孔加入 20 µL 5 mg/mL的 MTT 溶液，并将培养板在 37°C、5% CO2 的培养箱中继续孵育 3 小时。

12. 从每孔中移除培养基，每孔加入 100 µL DMSO 以溶解染料。

13. 将培养板置于摇床上孵育 15 分钟，使染料在 DMSO 中充分溶解。在两个不同波长（560 nm和 670 nm）处测量染料的吸光度。最后，比较相应的IC50 剂量，评估耐药性的获得情况。

14. 对于剩余 A2780细胞，按照表 1 中逐步递增剂量重复类似的紫杉醇处理周期。

15.对中间阶段进行 MTT 检测，以验证紫杉醇化疗耐药性的形成情况。

16. 使用以下公式计算耐药指数：RI（耐药指数）= 耐药细胞的 IC50 值 / 对照细胞的 IC50 值。