实验干活-一文解决密度梯度离心法分离外泌体实验

一概述

外泌体（Exosome）是一类由细胞主动分泌、具有脂质双分子层膜结构的纳米级细胞外囊泡（EVs），其直径范围通常在30-150纳米之间。它们起源于细胞内的内体途径：细胞膜内陷形成早期内体，进而发育为富含腔内囊泡（ILVs）的多泡体（MVBs），最终MVBs与质膜融合，将腔内囊泡释放至胞外，即形成外泌体。外泌体的膜上富含特异性蛋白（如四次跨膜蛋白CD9、CD63、CD81，以及整合素、黏附分子等），这些标志物有助于其鉴定；其腔内则包裹着复杂多样的功能性生物分子，包括蛋白质（酶、信号分子、热休克蛋白等）和多种核酸（如mRNA、microRNA、长链非编码RNA、环状RNA及DNA片段）。外泌体具有普遍分泌性，几乎可由所有类型的体细胞产生和释放，包括免疫细胞、神经元、上皮细胞、内皮细胞、干细胞、癌细胞等。它们广泛分布于多种生物体液中，如血液、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、胆汁等。作为细胞间关键的通信媒介，外泌体通过将其携带的“分子货物”传递给靶细胞，在介导免疫调节、组织修复、神经信号传递、肿瘤进展与转移等生理和病理过程中发挥核心作用。其蕴含的特定分子信息（“分子指纹”）及在体液中的稳定性，使其在疾病诊断（液体活检）、预后评估、药物递送载体开发等领域展现出巨大的应用潜力。

（图1 外泌体的结构与功能）

密度梯度离心法是一种基于颗粒密度差异的高纯度分离技术，通过超速离心将样品（如细胞培养液或血液）置于预先形成的密度梯度介质（如蔗糖或碘克沙醇溶液）中，在强大离心力作用下，不同密度的颗粒（如外泌体、杂质蛋白、细胞碎片）会沉降或上浮到与其自身浮力密度相匹配的梯度层区域；外泌体通常富集在密度约1.10-1.19 g/mL的区间，收集该层并清洗后即可获得纯度较高的外泌体，常被视为分离外泌体的“金标准”方法，尤其适用于对纯度要求极高的下游分析。

（图2 密度梯度离心法）

二实验原理

密度梯度离心法分离外泌体的核心原理是利用外泌体与杂质颗粒的浮力密度差异（外泌体密度范围为1.13~1.19 g/mL，显著区别于污染物），在超速离心力场中实现选择性分离。该方法通过以下机制运作：

浮力密度平衡：

在蔗糖或碘克沙醇等惰性介质形成的预制密度梯度（通常1.10~1.30 g/mL）中施加超速离心（>100,000 ×g），颗粒受离心力驱动迁移，直至其浮力密度（ρ颗粒）与介质密度（ρ介质）相等（ρ颗粒=ρ介质），此时离心力与浮力平衡，颗粒富集于对应密度层。

分离路径设计：

自上而下法：样本加载于梯度顶部，颗粒在离心力作用下沉降，最终停泊于等密度层（适用于常规样本）。

自下而上法：样本与高密度介质混合置于管底，密度小于介质的颗粒在离心力场中上浮至等密度层（适用于低密度杂质多的样本）。

介质选择：

碘克沙醇因接近生理渗透压（显著低于蔗糖），能最大限度维持外泌体膜结构完整性和生物活性，成为优化方案；而蔗糖因高渗透压可能导致囊泡塌陷。

分离效果：

外泌体富集于1.13~1.19 g/mL区间，高密度杂质（如细胞碎片，>1.25 g/mL）沉至管底，低密度污染物（蛋白质聚集体、脂蛋白，<1.10 g/mL）滞留于顶层，实现高纯度分离（去除>90%杂蛋白）。

此方法虽因超长离心时间（>18小时）和低回收率受限，但仍是获得高纯度外泌体的"金标准"。

（图3 密度梯度离心法流程）

三实验材料

表1 样本预处理材料

表2 密度梯度介质与制备

表3 梯度构建与离心耗材

表4 超速离心设备

表5 梯度收集与清洗材料

表6 外泌体保存与质控材料

四实验步骤

1. 样本预处理（全程4℃操作）

去除细胞碎片：细胞培养上清液/体液→300 ×g, 10 min→弃沉淀（去死细胞）。上清→2,000 ×g, 20 min→弃沉淀（去大颗粒）。

过滤除杂：过 0.22 μm PVDF滤膜→去除>200 nm颗粒。

样本浓缩（可选）：用100 kDa超滤管浓缩10倍（4,000 ×g, 30 min）→提高外泌体浓度。

2. 碘克沙醇梯度制备（以不连续梯度为例）

表7 梯度配方（从管底至管顶）

操作步骤

在13.2 mL超速离心管中，从高密度向低密度逐层叠加：用长针头注射器紧贴管壁，缓慢注入1.5 mL 40%碘克沙醇（底层）。依次叠加2 mL 20%、2 mL 15%、1.5 mL 10%溶液（避免界面混合）。

梯度静置：4℃直立放置2小时→扩散形成伪连续梯度。

3. 样本加载与超速离心

加载样本：取1–2 mL预处理样本，小心铺在梯度顶层（用200 μL移液器沿管壁缓慢加样）。

平衡离心管：用稀释缓冲液（PBS）平衡对称管重量（差值<0.01 g）。

超速离心：转子：SW 41 Ti水平转子；条件：100,000 ×g, 4℃, 16–18小时

注：若用垂直转子（VTi 65.2）→150,000 ×g, 4℃, 4小时

4. 梯度收集与外泌体回收

收集工具：梯度穿刺针

离心后轻取离心管，避免振动分层界面。从管顶穿刺，自下而上逐层收集（流速≤0.5 mL/min）：每管收集0.5 mL馏分（共12–15管）。

定位外泌体层：外泌体富集于 1.13–1.19 g/mL层（对应碘克沙醇15–20%区间，通常为第4–7管）。

验证方法：折射仪测密度，或留样做WB检测CD63。

清洗去介质：合并目标馏分+加入3倍体积预冷PBS（含蛋白酶抑制剂）。

二次超速离心：转子：70 Ti固定角转子（Beckman）；条件：100,000 ×g, 4℃, 70分钟→弃上清。

重悬沉淀：用100 μL PBS轻柔吹打重悬外泌体（避免气泡）→即分装冻存（-80℃）。

五注意事项

避免RNase污染：

所有耗材需DEPC水处理，操作戴手套。

梯度稳定性：

手动分层后静置2 h（4℃）使界面扩散为伪连续梯度。

回收率优化：

收集时合并1.13–1.18 g/mL区间所有馏分，提高得率。

介质残留检测：

碘克沙醇在340 nm有吸光度，可用分光光度计监测清洗效果。

实验成功依赖高生物相容性介质（碘克沙醇）、适配离心耗材、严格低温操作及去污染措施。此清单覆盖从样本处理到质控的全流程核心材料，确保分离高活性外泌体。

六遇到问题及解决方案

表8 梯度制备常见问题

表9 离心过程常见问题

表10 收集与清洗常见问题

表11 外泌体产量与纯度常见问题

表12 外泌体活性与完整性异常

参考：

[1] Raghu Kalluri, Valerie S. LeBleu ,The biology, function, and biomedical applications of exosomes.Science367,eaau6977(2020).DOI:10.1126/science.aau6977.

[2] Lin MC, Chen SY, He PL, Luo WT, Li HJ. Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes. J Vis Exp. 2017 Jun 3;(124):55736. doi: 10.3791/55736.