求助！志贺氏菌相关实验

有大佬做过志贺氏菌嘛？我目前一直在敲除福氏志贺氏菌(2a)毒力大质粒中的mxi基因，破坏T3SS。

方法：CRISPR/Cas9双质粒系统，先导入表达pCas的质粒，诱导表达后同时电转表达sgRNA的质粒及同源臂（同源臂长度1400bp），进行同源重组。电转条件：1.8 kv，25uF，200Ω

遇到的问题：（1）电转涂双抗板菌株不长（用低盐和含葡萄糖培养基有菌株生长，但还是特别少）;

（2）涂板后第二天做菌检，PCR条带很亮显示敲除（外部引物变短，内部引物扩增不出来），但是！！我想转接出来再做其他实验的时候，条带变得特别弱，和阴性条带一样甚至更弱，推测是质粒丢失。我再去取涂板的单克隆扩增，也都难扩增出来 → 我想过是质粒丢失，但查文献是有比例的，应该不会像我这样都没有吧（用基因组引物确认过，也用16S验证过，是志贺氏菌）

另外：我也用刚果红培养基确认过，敲除mxi后菌落颜色都变白，不像WT那么红。我以为是应该在30℃培养，但文献中只有电转后是30℃复苏及涂板后培养，之后的实验也都是37℃，我37℃和30℃用刚果红培养的敲除株也都是白色，我还是不太相信之前没有丢失，放在4℃冰箱一两天就丢失了........

做了两个月了，快被折磨死了，想请大佬们传授一下经验o(╥﹏╥)o