转染及siRNA的转染

除了实验组外，还要再加一个Mock Transfaction。

1转染前一天，接种细胞到6孔板中，每孔1×10^6cells，密度为50%以上转染比较合适。

2第二天取出前一天的细胞，离心，用1×PBS洗一遍之后，离心，更换新的培养基，这里的培养基为预热的DMEM basic，每孔加2mL。注意动作轻柔，以免细胞状态不好。

3配转染液：准备2个EP管，分别加入250ul的opti-MEM。

4取已经计算好的siRNA，每孔100pmol，相当于20umol的5ul，逐滴加入，用小枪头靠近液面慢慢打出，轻轻吹打混匀（一定要轻轻地），标记为siRNA管。

5吸取适量lipo 2000（6孔板用10ul）于另一个管子中，小心吹打1-3下。

注意：lipo吹打后要手动震荡轻弹管底混匀，室温放置5min，可见管底液体稍微浑浊。

6室温分别放置5min后，将以上2管混匀，记得顺序是将lipo2000管加入siRNA管，室温放置20min，如遇实验冲突，可以放置久一点，但不能短于20min。

7将该混合液体轻轻滴入到需要转染的孔板中，轻轻摇板将其与培养基混匀。

8将cell放入培养箱中，一般在6-10h内换液，lipo毒性较大，除非强壮细胞系（如293T），其他细胞很难接受16h以上转染。换液换成完全培养基。

注：如果转染后发现亖亡细胞较多，可在转染结束之后更换含血清的完全培养基。

9于转染后24小时收集细胞，加入trizol，提取RNA。进行RT- 企鹅的1/2 PCR。