高纯胸腺肽α1的制备

摘要：为了获得高纯产品,在制备胸腺肽α1(Tα1)工艺中分别对合成、纯化两步骤进行控制。在固相多肽合成过程中,以TBTU/HOBt/DIEA体系作为缩合试剂,在易形成α螺旋和β转角的肽序位置,通过采用HOBt/DIC补投的方法促使偶联反应完全。在分离纯化阶段,结合反相色谱和离子色谱的优势,以反相离子对液相色谱法为主要分离手段,通过多步分离实现纯化。获得的粗肽纯度为67.2%,胸腺肽α1产品纯度达99.5%以上,总收率为17.2%。此法可作为制备高纯多肽药物的有效手段。

关键词： 胸腺肽α1 固相多肽合成 反相离子对液相色谱

引 言

胸腺肽α1(Tα1) [1] 临床用作免疫调节剂,其原料药均为化学合成药。在Tα1合成过程中,大多数氨基酸都容易消旋而产生很难除去的消旋杂质,最明显的是赖氨酸、组氨酸、丝氨酸等的消旋化 [2-5] ;同时偶联反应过程中的不完全反应及肽链的断裂,从而引起缺失肽的出现,特别是形成二级结构α螺旋和β转角处的氨基酸,更容易发生氨基酸缺失现象 [6] ,这些杂质降低了合成收率,加大了下游纯化的难度。Tα1的纯化通常采用反相色谱法和离子色谱法,反相色谱具有极高的分辨率,可以分离大部分杂质,离子色谱的分离基于带电荷的差异,常作为反相色谱的补充纯化合成多肽。类似Tα1的长肽(15肽以上)的制备,由于消旋杂质和缺失杂质增多,且由于具有一定的空间结构,杂质与目的产品极性相差很小,简单运用这些单一方法,很难制备出合格精肽,而要制备出高纯度产品,即使采用多种色谱分离,也很难成功。

本文采用固相法合成Tα1 [7] ,以TBTU/HOBt/DIEA体系作为缩合试剂 [8-9] ,在形成二级结构的氨基酸位置采用重投的方式,降低缺失杂质和消旋杂质的产生,提高合成工艺收率和粗产品纯度;采用反相离子对色谱法作为纯化手段,以反相填料为固定相,离子对试剂为洗脱液,结合反相色谱和离子色谱的优势 [10] ,避免使用多种色谱分离的复杂过程,制备高纯Tα1。

1 方法

1.1 Tα1肽树脂的化学合成

1.1.1 Fmoc-Asn(Trt)-Wang的制备

取Fmoc-Asn(Trt)-OH、DIC、HOBt、DMAP配制氨基酸偶联液 [11-13] ,20℃以下活化15～20 min,加入DCM溶胀的Wang树脂中进行偶联反应,反应温度控制在23～28℃,反应时间为2 h,抽去偶联液,使用DMF洗涤树脂。取Fmoc-Asn(Trt)-Wang测定替代度sub=0.20 mmol·g-1 [14-15] 。

1.1.2 肽树脂合成过程

以Fmoc-Asn(Trt)-Wang为载体,采用Fmoc固相合成法合成Tα1肽树脂(树脂上连接Tα1全肽)。TBTU/HOBt/DIEA体系为缩合体系,反应温度保持在25～30℃,反应时间90 min;活化时反应液温度维持在20℃以下,活化时间15～20 min;茚三酮显色 [16] 反应检测氨基酸偶联及脱保护基是否完全;合成规模为1.00 mmol,每次偶联反应结束后脱除Fmoc保护基团,再进行下一个氨基酸的偶联,按照Tα1氨基酸序列依次偶联相应氨基酸,最后乙酰化得到Tα1肽树脂。其中第5～8位、第17～24位氨基酸 [17] (以氨基端的Ser为第1位,羧基端的Asn为第28位),采用HOBt/DIC缩合体系进行重投,重投步骤前不洗涤、不脱除Fmoc保护基团。

氨基酸重投:在氨基酸投料偶联结束后,可能存在固相氨基酸树脂上还有裸露的氨基未结合所要偶联的保护氨基酸,这时采用重投的方法。将反应器中偶联液抽取,加入HOBt/DIC体系活化液继续反应,中间不洗涤、不脱除Fmoc保护基团,反应温度30～35℃,反应时间90 min。活化温度保持在20℃以下,活化时间在15～20min。

对比实验:比较重投的效果,进行平行实验,肽树脂制备过程中不做重投操作,其他反应条件相同,比较合成效果。

1.1.3 Fmoc基团脱除

脱保护条件:比例为1∶4的六氢吡啶/DMF溶液配制成脱保护液,两次脱Fmoc保护基团之间用DMF洗涤1次,脱保护温度25～35℃,时间8～10 min [18-19] 。

1.1.4 洗涤

每个氨基酸偶联结束后用DMF洗涤两次,再进行脱Fmoc保护操作,脱保护后DMF洗涤6次,洗涤时间均为1 min。肽树脂Tα1-Wang合成完毕后依次按DMF×2、MeOH×1、DCM×1、MeOH×2次洗涤。

1.1.5 Tα1-Wang肽树脂切割

肽树脂Tα1-Wang干燥后用三氟乙酸裂解液(TFA/苯甲硫醚/EDT/水=90/5/3/2)切割,以茴香硫醚为捕获剂,用乙醚洗涤裂解液,离心取沉淀反复用乙醚洗涤4次,真空干燥箱内干燥至恒重,最终得到Tα1粗肽。

1.2 反相离子对高效液相色谱检测Tα1

依照2010版药典胸腺法新有关物质检测项下方法 [20] ,检测本实验室制得的Tα1。以反相C18色谱柱为固定相,以乙腈-水-磷酸(140∶860∶1)为流动相A相,以乙腈-水-磷酸(250∶750∶1)为流动相B相,检测波长210 nm,检测洗脱梯度见下表1。

表1 中国药典标准检测Tα1洗脱梯度

采用反相离子对高效液相色谱法,检测本实验室制得的Tα1:以反相C18色谱柱为固定相,以10 mmol·L⁻¹的四甲基氢氧化铵水溶液(pH=5.7)为流动相A,以乙腈为流动相B,检测波长210 nm,检测洗脱梯度见表2。

表2 反相离子对液相色潽法检测Tα1洗脱梯度

1.3 分离纯化

使用制备高效液相色谱仪分离纯化粗肽,检测波长210 nm,洗脱流速15 ml·min⁻¹,上样量为100 mg目的肽,采用三步纯化法,每步纯化分三段收峰,取峰顶部分进行下一步纯化。第一步,粗肽溶解于纯化水中,浓度为10 mg·ml⁻¹目的肽,pH值调至2.0,上样后以0.1%的TFA水溶液为A相,乙腈为B相进行洗脱,截取纯度为85%以上的目的物作为峰顶部分,旋蒸浓缩除去乙腈后进行二步纯化;第二步纯化,将除去乙腈的一步纯化峰顶部分调pH值至5.7,上样后以10 mmol·L⁻¹的四甲基氢氧化铵水溶液(pH=5.7)为A相,乙腈为B相进行洗脱,截取纯度为97%以上的样品为峰顶部分,旋蒸除去乙腈后进行三步纯化;第三步纯化,将二步纯化峰顶部分上样后,纯水为A相,甲醇为B相进行洗脱,截取纯度为99%以上的目的样品,浓缩冷冻干燥后获得Tα1冻干粉。洗脱梯度见表3。

表3 Tα1纯化洗脱梯度

2 结果与讨论

2.1 Tα1的固相合成

合成规模为1 mmol,对照组肽树脂切割、洗涤、干燥后得到粗肽2.502 g,纯度41.3%,外标法测定肽含量为1.001 g,合成目的肽收率32.2%;复投组肽树脂切割、洗涤、干燥后得到Tα1粗品2.716 g,理论值为3.108 g,粗肽纯度67.2%,粗肽收率为87.4%,外标法定量测得目的肽含量为1.286 g,合成目的肽收率41.4%,合成收率提高28.6%(图1)。可见,在肽序第5～8位、第17～24位氨基酸采用重投的手段,明显提高了合成收率,降低了杂质的产生。同时,采用TBTU/HOBt/DIEA作为合成偶联试剂合成Tα1,高于文献[12-13,21]报道。

图1 高效液相色谱法检测合成Tα1粗肽

2.2 反相离子对色谱条件确定

按照1.4节中的色谱条件,取自制Tα1对照品做HPLC检测,检测结果见图2。

图2 采用不同检测体系检测Tα1图谱

由图2可以看出,采用离子对试剂四甲基氢氧化铵作为洗脱液,检测出自制对照品纯度低于标准体系检测纯度,色谱柱效得到了保证的同时,对有关物质的分离效果优于常规方法。

2.3 Tα1纯化

第一步纯化,截取保留时间为20.01～24.75 min之间的洗脱目的峰,经HPLC检测纯度92.1%,含量为0.835 g,收率为64.9%。第二步纯化,截取保留时间为30.57～34.57 min之间的洗脱目的峰,经HPLC检测纯度98.9%,含量为0.685 g,收率为82.0%。第三步纯化,截取保留时间为91.01～96.75 min之间的洗脱目的峰,经HPLC检测纯度99.6%,含量为0.535 g,收率为78.1%,三步纯化的制备色谱图见图3。

图3 Tα1三步纯化制备图谱

三步分离纯化Tα1粗肽,分别得到一步纯化液、二步纯化液、三步纯化液,3部分分析检测色谱图见图4。

图4 分离纯化过程中Tα1图谱检测

三步纯化后得到精制液,纯化总收率为41.6%。工艺中Tα1产品纯度在99.5%以上,总收率17.2%。第三步纯化峰顶部分经冻干后得到0.542 g Tα1干粉。以标准品为对照,高效液相色谱法检测可见,两者保留时间吻合。

以TFA-ACN体系为洗脱液纯化粗肽,对前杂去除效果好,其色谱峰起峰快,所以在主峰靠前部分要多分几段,以HPLC检测取纯度85%以上的洗脱目的峰,峰后拖尾部分目的肽含量低,后面可以舍去。

​合成多肽的分离纯化纯度要求越高,纯化难度越大。一步纯化过程中,目的肽纯度由67.2%提高得到纯度92.1%,此过程中主要除去结构性质相差较大的杂质,洗脱溶液梯度及色谱柱效决定了纯化效果,纯化相对简单。第二步分离纯化要将目的肽纯度进一步提高,洗脱梯度对分离提纯的影响不再是关键,韩香等 [21] 介绍了用离子交换柱作为反相色谱的补充用于分离纯化Tα1,得到良好的效果,采用离子对试剂四甲基氢氧化铵作为洗脱液,是将反相机理和离子交换机理相结合 [22] ,兼有反相色谱和离子色谱的优点,实验中Tα1的第二步纯化,目的溶液由92.1%的纯度提高到98.9%,效果显著,且收率高达82.0%,可见,离子对反相高效液相色谱法对Tα1分离效果显著,四甲基氢氧化铵-乙腈体系用于分离Tα1有着较大优势。

第二步纯化引入了离子对试剂,研究人员曾经尝试用透析法、凝胶过滤法、离子交换法等脱除四甲基氢氧化铵,效果均不理想。本文第三步采用纯水-甲醇体系梯度洗脱,不仅达到对产品脱盐的目的,且进一步提高了目的产物纯度。

2.4 质谱分析

采用MALDI-TOF-MS测定Tα1相对分子质量,图5是Tα1质谱图,确定产品相对分子质量3108.2,与Tα1标准相对分子质量相符。

图5 MALDI-TOF-MS测定Tα1分子量3108.2

2.5 离子对试剂的选择

胸腺肽α1是酸性较强的28肽,等电点为4.2,在选择离子对反相高效色谱法分离合成粗肽时,本文选择pH值为5.7的10 mmol·L-1的四甲基氢氧化铵水溶液作为洗脱液A相。由于反相高效液相色谱填料对多数离子对试剂有较强的保留作用,离子对试剂不宜选择较高的浓度,以防止盐的析出及对反相填料键合相的破坏作用,一般选择10～20 mmol·L⁻¹的浓度;同时色谱柱及色谱系统在使用离子对洗脱液后,要用甲醇充分冲洗色谱柱,以消除离子对试剂的残留。pH值的选择主要依据目的肽的等电点,一般地,选择目的肽等电点两个单位的范围,以增加缓冲作用和对电荷相似的杂质的分离。反相填料通常耐受pH值范围为2～8,缓冲液的pH值选择要在这个范围内,近年来,新型的填料不断出现 [23] ,其耐受pH值的范围已扩展为1～12,为离子对试剂的选择提供了方便。

离子对试剂的选择通常是与目的肽形成离子对,也可以与特定的杂质形成离子对,进行改变分离行为。

3 结 论

采用TBTU/HOBt/DIEA体系作为合成Tα1的缩合试剂,控制反应条件,降低消旋杂质产生,并且在形成α螺旋和β转角的肽段进行重投,减少了缺失肽杂质,最终成功合成了胸腺肽α1粗肽,纯度67.2%高于一般水平;采用三步纯化法对合成粗肽进行分离纯化,以反相离子对试剂作为洗脱液,提高了分离纯化的效率,得到99.5%以上的高纯产品,总收率达到17.2%。

反相离子对色谱法综合了反相色谱和离子色谱的优点,可以作为分离多肽的有效手段。

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