3C-qPCR|染色体构象捕获定量分析：一个高阶的分子生物学实验

什么是3C? 为什么要进行3C-qPCR？

3C是染色质构象捕获-Chromosome Conformation Capture，3C-qPCR 是染色质构象捕获后通过实时定量PCR进行分析检测，定量检测两个特定基因组片段之间的空间互作强度。应用场景：揭示基因调控关系；比较不同条件下的染色质结构变化；鉴定结构变异影响。

实验步骤：（原理和细节放最后，！！！但后面更重要。）

【单细胞准备】

1| 贴壁细胞的处理方法：

①　去掉培养基，用PBS洗两次；

②　加入1ml的0.25%胰酶37℃孵育5min；

③　加入9ml的10%血清培养基终止消化以及重悬；

④　室温、400g离心1min；

⑤　去上清，用500ul的10%血清培养基重悬（按每1*10⁷个细胞500ul）；

⑥　用40um的细胞过滤器过滤细胞，制成单细胞悬液。

【甲醛交联】

2| 交联，每1*10⁷个细胞添加9.5ml的2%甲醛/10%血清/PBS，室温滚动孵育10min；注：如果甲醛浓度会影响消化效率，选择1%的甲醛。注意：甲醛是有毒物质。

3| 将反应管转移到冰上，添加1.425ml 1M 预冷的甘氨酸淬灭交联反应。注：甘氨酸将使未与生物样品反应的过量甲醛失活。此处描述的甘氨酸浓度对于大多数生物样品来说已经足够了。但是，如果样品中的游离氨基含量低，则淬灭可能不完全;在这种情况下，应增加甘氨酸浓度，然后再立即进行第 4 步。

4| 4℃ 225g离心8min，去除上清液。

【细胞裂解】

5| 加入5ml冷裂解液，冰上孵育10min。注：获得均匀的细胞核制备很重要，这可以通过轻轻上下移液混合物来促进。根据细胞类型，可能需要更严格的裂解缓冲液来制备细胞核。

6| 4℃ 400g离心5min，去除上清。

**暂停点：沉淀的细胞核可以在液氮中冷冻并在 -80 ℃下储存数月。

【消化】

7| 在0.5ml 1.2X的限制性内切酶中重悬细胞核，转移到EP管中。

8| 放置到37℃中添加7.5ul 20%SDS（终浓度：0.3%SDS）；

9| 37摄氏度、900rpm震荡孵育1小时；

10| 加入50ul 20% （v/v） Triton X-100；

11| 37摄氏度、900rpm震荡孵育1小时；

12| 从中吸取5ul试样标注为未消化的对照DNA，此试样可以短暂保存在-20℃中直到需要检测消化效率；13| 加入400U的选择限制性内切酶，37摄氏度、900rpm震荡孵育过夜；

14| 从中吸取5ul试样标注为消化的对照DNA，如果要继续处理剩余样品请继续往下做，如果要确定消化效率请将12步和14步吸出的样品按照框2进行，数据分析与22-34步同时进行；

【连接】

15| 添加40ul 20%的SDS（终浓度1.6%）到14步剩余的样品中；

16| 65℃ 900rpm震荡孵育20-25min。

17| 随后将这些核物质转移到50ml的离心管中；

18| 添加6.125ml的1.15X连接buffer；

19| 添加375ul 20%的Triton X-100；

20| 37℃ 温和震荡孵育1小时；

21| 添加5ul连接酶（100U）16℃孵育4小时，随后室温（18-22℃）孵育30min；

22| 添加30ul 10mg/ml蛋白酶（总量300ug）；

23| 65℃过夜孵育进行解交联；

【DNA纯化】

24| 添加30ul 10mg/ml的RNA酶；

25| 37摄氏度孵育30-45min；

26| 添加7ml酚氯仿并剧烈混合；

27| 室温2200g离心15min；

28| 转移上清到一个新的50ml离心管中，加7ml蒸馏水，1.5ml 2M pH5.6乙酸钠，然后加入35ml乙醇；注：沉淀前增加体积将稀释连接缓冲液中存在的 DTT 并防止其沉淀（白色沉淀）；

29| 混合并在-80摄氏度放置1小时；

30| 4℃ 2200g 离心45min；

31| 去除上清液，加入10ml的70%乙醇；

32| 4℃ 2200g 离心15min；

33| 去除上清，室温短暂干燥沉淀（按照酒精风干速度大约3min）；

34| 将 DNA 沉淀溶解在 150 μl 10 mM Tris pH 7.5 中。这样得出的产物便可以作为3C模版进行qPCR分析，如果需要额外的消化以最大限度地提高模板的可及性，请在继续步骤 35 和 qPCR 分析之前按照框 1 中的程序进行作。

**暂停点：3C 模板可在 -20 ℃下保存数月。

【样品纯度评估】

35| 将DNA等分并按2-10倍稀释，添加基因组DNA使得DNA总量不变；使每个反应管的DNA总量在50-100ng之间。

36| 设置10ul qPCR检测体系评估样本的纯度，可以选择任意的3C引物进行检测。使用对照模板的连续稀释液，在同一次运行中执行标准曲线。

37| 使用下表的条件运行 qPCR。检查实时荧光定量 PCR 的定量是否根据稀释因子而减少。如果不是这种情况，则样品纯度不合适，应丢弃样品。

【浓度测定以及调整】

38| 为了准确测定 3C 样品的 DNA 浓度，需要将其与已知浓度的基因组 DNA 的参考样品进行比较。这可以通过 SybGreen 对 50 × 稀释的 3C 样品和参比样品进行定量PCR，使用“内部”引物对来完成，该引物对不会在所用任何限制性内切酶识别的位点之间扩增，“这边的意思大概是，选择在基因座互作内部的引物，或者不跨越酶切位点的任意内部片段，这样可以确保其不受酶切以及后续操作影响”。除了qPCR之外也可以在同一块琼脂糖凝胶上，对3C样品和参比样本进行电泳比较。

染料法PCR：

1. 准备50倍稀释的3C样本（34步得到的产物）和连续稀释的参考DNA；
2. 设置20ul体系的PCR体系（与常规qPCR体系一致，可以按照试剂盒说明说操作）；
3. PCR条件（按照你购买的实际试剂盒说明设置）；
4. 通过将样品的CT值与标准曲线进行比较来确定DNA的浓度。

琼脂糖凝胶分析：

1. 制备1/5、1/10、1/20和1/40的3C稀释液的样品和已知DNA浓度的DNA样品。
2. 在（0.8–2%）琼脂糖凝胶上电泳，连接的3C样品（和未消化的基因组参考样品）将作为单个高分子量条带运行。比较连接的3C样品和参考样品之间的DNA量，并通过ImageQuant软件，分析处理后的图像以确定DNA浓度。

39| 用无菌水调节原始的3C样本DNA浓度至50ng/ul（误差值10%），通过步骤38来验证浓度。

【实时PCR定量连接产物】

40| 对 1 μl（含有~50 ng DNA）的“调整”3C样品（来自步骤 39）进行连接产物的 TaqMan 实时 PCR 定量。使用步骤 36 中描述的反应条件。

41| 对于每种连接产物，使用步骤 37 中列出的 PCR 参数运行 qPCR。

【材料】

A.       组织或细胞

B.       10% FCS/DMEM

C.       10% FCS/PBS

D.       0.25%胰蛋白酶

E.        37%甲醛

F.        甘氨酸 1M

G.       裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.1 mM EGTA;1X蛋白酶抑制剂）

H.       2.5% (w/v) collagenase type 1

I.          20% （w/v） 十二烷基硫酸钠 （SDS）

J.         Triton X-100

K.       高浓度限制性内切酶（40 U μl−1)

L.        T4 DNA 高浓度连接酶 （20 U μl−1）

M.      10 × 连接缓冲液（660 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM DTT; 50 mM MgCl2; 10 mM ATP）

N.       Ribonuclease A (RNase A), 1 mg ml⁻¹

O.       Proteinase K (PK), 10 mg ml⁻¹

P.        PK buffer (5 mM EDTA, pH 8.0; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.5% SDS)

Q.       40 μm 细胞过滤器 （352340 Falcon）

【酶切位点选择】

原则：

①　 非甲基化敏感限制酶；

②　 粘性末端酶；

③　 回文序列酶；

④　 不存在摆动碱基的酶切位点；

⑤　 酶切温度最好是37℃，太高的温度会导致解交联；

⑥　 有合适的酶切buffer且适合条件下切割效率可以达到100%；

⑦　 整个片段被较为均匀地切开，比较推荐MseI，BfaI，CviQI ，NlaIII ，FspBI（与BfaI位点相同）等酶；

⑧　 为了得到准确的连接产物，选择crosslinked fragment 上存在的酶切位点，并且最好存在两个以上的酶切位点，这样子可以进一步说明互作。

！！！这部分比较难（不懂的话就选我⑦推荐的，这样只需要再满足条件⑧就行了）

【引物】

1| 用于评估 DNA 消化效率的对照 PCR 引物

原则：设计至少两对跨酶切位点的引物以及至少一对非跨酶切位点的引物。最后可以通过琼脂糖胶或者CT值进行比较。（选择在基因坐内部非结合区，可以）如下图所示↓。

2|用于上样调整的正向和反向“内部”引物。

Internal primers设计原则：一般选择稳定基因比如GAPDH等，避开选择的酶切位点，设计时选择整个基因区非CDS/非mRNA。内部引物同时可以用于样本纯度检测。

3|用于定量 3C 反应的常数和测试 PCR 引物

⑴设计一端作为常数引物端（不变端，最好针对一个位点设计两个距离酶切位点差10-50个碱基左右，两端都可以作为不变端）；⑵测试引物遍布在整个基因区域，每隔一段距离设计一个位点；⑶常数引物以及测试引物都在每个酶切位点附近，引物方向一致（考虑的是酶切位点翻转之后重新连接，不理解的可以假设场景：一个片段前后相同的酶切位点有几种连接方式）

4|TaqMan 探针

探针设计在靠近常数引物一端，与常数引物相反的链作为模板。这里记住只有探针的模板（也可以说是方向）是不同的。

【3C-qPCR的原理】

3C-qPCR结合了染色质构象捕获（3C）与定量PCR（qPCR），用于定量检测特定DNA片段在细胞核中的空间亲近程度。其原理包含以下几个关键步骤：

1. 细胞交联（Cross-linking）

• 用甲醛处理细胞，使空间上邻近的DNA片段及其结合的蛋白质发生共价交联。这样互作的DNA片段被“锁”在一起。

2. 基因组消化（Digestion）

• 提取交联后的细胞核，用特定限制性内切酶切割基因组。切割将基因组分解成大片段，空间上邻近、但线性上可能很远的DNA片段仍然被交联在一起。

3. 稀释连接（Ligation in Dilution）

• 将被消化的DNA进行强力稀释，此时只有交联在一起的、空间临近的DNA断端能互相高效连接（因为其物理接近）。
• 用DNA连接酶将邻近片段连接，产生“嵌合DNA”片段，反映染色质空间构象。

4. 去交联和DNA纯化（Reverse Cross-linking）

• 去除交联，将DNA回收纯化，得到含有“交联连接片段”的总DNA。

5. qPCR定量检测

• 针对可能产生“嵌合片段”（即交联在一起并被连接的两个基因组区域），设计特异性引物。
• 采用qPCR对目标嵌合片段进行定量扩增，荧光信号强度与原始DNA片段的链接频率成正比。
• 通过标准曲线或与对照样本比较，评估两个DNA区域在空间上的亲近或互作强度。

这个技术的核心思想是：物理距离近的DNA片段更容易被交联并连接，最后通过qPCR反映联系的频率，揭示其空间结构关系。

2002年一篇science文章将3C染色体技术暴露于大众视野，2007年再次改进。

现在已经形成了成熟的高通量测序技术。

想要完全学会和理解这个技术，建议看看这两篇参考文献。

1. Dekker J, Rippe K, Dekker M, Kleckner N. Capturing chromosome conformation. Science. 2002;295(5558):1306-1311. doi:10.1126/science.1067799
2. Hagège H, Klous P, Braem C, et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nat Protoc. 2007;2(7):1722-1733. doi:10.1038/nprot.2007.243