手把手教你 BCA 法测蛋白浓度

一、实验步骤

在进行生物医学BCA法检测蛋白浓度实验之前，需要提前准备好以下物品：蛋白样品、96孔板、计算器、白枪头、黄枪头、排枪、2.5μL枪、20μL枪、BCA试剂盒、涡旋仪以及垃圾桶。

1、标记与加样

在96孔板上清晰标记好每个孔的上样名称，以便后续操作时能够准确区分。对于标准品孔，分别加入20μL PBS缓冲液；对于样品孔，则分别加入18μL PBS缓冲液。这一步骤是为后续加入蛋白样品和标准蛋白溶液做好准备。

2、蛋白样品的加入

在样品孔中一一对应加入2μL的蛋白样品（注意：蛋白样品需提前稀释10倍）。稀释后的蛋白样品浓度应适中，以便在后续检测中获得准确的吸光值。  

 3、标准蛋白溶液的梯度稀释

在标准品孔的第一个孔中加入20μL标准蛋白溶液（浓度为2μg/μL）。随后，将该孔中的溶液充分混匀后，吸出20μL加入到下一个孔中，继续混匀后再吸出20μL加入到下一个孔，如此类推，直到最后一个孔（第8个孔）不加标准蛋白溶液。通过这种方式，可以依次获得浓度分别为1μg/μL、0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.125μg/μL、0.0625μg/μL、0.03125μg/μL、0.015625μg/μL和0μg/μL的标准蛋白溶液梯度。这一步骤对于后续绘制标准曲线至关重要。  

 4、BCA工作液的配制与加入

根据96孔板的总孔数，额外多计算5个孔的损耗量。每个孔需加入200μL BCA工作液。按照BCA试剂盒的说明书，计算总共需要的BCA工作液用量。BCA工作液的配比为A液与B液的比例为50:1。准确配制好工作液后，将其均匀加入到每个孔中，确保每个孔的液体量一致。

5、去除气泡

使用注射器针头轻轻戳破液体表面的气泡。这一步骤是为了避免气泡对后续孵育和吸光值检测产生干扰，确保实验结果的准确性。

6、孵育

将96孔板放入37℃的孵箱中孵育30分钟。孵育过程中，蛋白样品与BCA工作液会发生反应，生成可检测的显色产物。  

 7、吸光值检测

孵育结束后，将96孔板取出，放置在酶标仪上进行吸光值检测。将酶标仪的波长设置为562nm，分别读取每个孔的吸光值。吸光值的高低将直接反映蛋白浓度的大小。

二、注意事项 

   为了确保生物医学BCA法检测蛋白浓度实验的准确性和可靠性，以下几点注意事项需要严格遵守：

1、标准品与工作液的准备

标准品溶液可以根据实验需求现配现用，也可以在配制后置于-20℃保存长达一年，但需注意其保存条件必须严格控制，避免反复冻融导致变性或降解。然而，BCA工作液则必须现配现用，切勿提前配制或保存，以确保其反应活性和稳定性。 

2、复孔设置与数据处理

为了提高蛋白浓度测量的准确性和重复性，建议每个样品至少设置3个复孔。在数据处理时，如果发现某些复孔的吸光值与其他孔相差较大，可能是由于加样不准确或反应不完全导致的离群值，应考虑剔除这些异常数据，以避免对最终结果产生误导。

 3、标准曲线的重要性

BCA法检测蛋白浓度时，结果容易受到孵育时间、温度以及操作步骤等因素的影响。因此，建议每次实验都重新制作标准曲线，而不是依赖以往的数据。通过每次实验都绘制新的标准曲线，可以有效校正实验条件的变化，从而提高测量结果的准确性。

 4、标准曲线绘制的准确性

在制作标准曲线时，务必明确横纵坐标的意义。通常，横坐标表示标准蛋白的浓度，纵坐标表示对应的吸光值。在绘制曲线时，应仔细核对数据，确保不会因坐标混淆而导致错误的浓度计算。

 5、加样操作的规范性

加样时必须确保加样量的准确性，避免因加样不准确导致的浓度偏差。同时，尽可能避免气泡的产生，因为气泡会干扰后续的孵育和吸光值检测。如果在加样过程中不可避免地产生了气泡，可在加样结束后使用注射器针头轻轻戳破气泡，并将96孔板放置在摇床上轻轻混匀片刻，以确保样品与BCA工作液充分接触，从而保证反应的均匀性。

 6、吸光值检测的及时性

孵育结束后，应尽快进行吸光值检测，并尽可能加快检测速度。因为随着时间的推移，反应体系可能会逐渐发生变化，导致吸光值出现偏差。因此，建议在孵育结束后立即进行检测，以获得最准确的结果。

 7、样品稀释的合理性

通常情况下，样品的蛋白浓度较高，直接测量可能会超出标准曲线的范围，导致无法准确计算浓度。因此，在测量之前需要用PBS溶液对样品进行适当稀释。稀释倍数可以根据样品的预估浓度和以往的经验进行调整，但务必确保稀释后的浓度在标准曲线的线性范围内，以便获得准确的测量结果。同时，记录稀释倍数，以便在最终计算蛋白浓度时进行相应的换算。