小鼠原代肝窦内皮细胞和肝星状细胞分离

之前在有个师兄的帖子下边留言，很多人问我要肝窦内皮细胞提取的protocll。现在发个帖子，有需要的自取，也欢迎大家一起交流。顺便求一株TMNK1细胞，可以用其他实验室有的细胞系交换。下面是正文。

一、肝脏灌注

1.缓冲液配制

EGTA缓冲液（也有文章里用的是Hanks，加EDTA/EGTA）

酶缓冲液(可以用Hanks加氯化钙)

GBSS平衡盐溶液（gibco有售，可用Hanks替代）

2.消化酶的配制

2.1本人前期用了两种酶，结合实验结果。推荐使用liberase，效果更好。一只小鼠1mg，溶解于40ml酶缓冲液，可以用酶缓冲液一次性溶解5mg（罗氏公司，一瓶5mg）。

2.2链蛋白酶/胶原酶D

链蛋白酶7mg，溶于15ml酶缓冲液。胶原酶D 7mg溶于20ml酶缓冲液。先灌蛋白酶再灌胶原酶。

2.3DNase 1，分离细胞时使用。过70um细胞筛后，可以加0.02ml/mlDNase1 孵育5min。如果是提取肝细胞，可能需要加。肝窦内皮细胞，星状细胞这类非实质细胞，可能是因为细胞量较少，实际操作过程中发现影像并不大。

3.密度梯度介质

以往的文章中报道的密度梯度介质主要有以下几种，percoll、碘海醇、碘克沙醇。因为我目前实验中用到了碘克沙醇和percoll，就介绍一下这两种的配制。碘海醇附件里有介绍。

3.1percoll的配制：首先配10x生理盐水和生理盐水，9体积的percoll原液加入1体积的10x生理盐水配成等渗的percoll（因为percoll是低渗的，所以要用10x生理盐水来配，这个时候所得的percoll后续计算时视为100％）。然后用生理盐水去稀释等渗的percoll，例如10ml 等渗percoll和10ml 生理盐水配50％percoll。

3.2碘克沙醇:我买的是optiPrep(60％碘克沙醇溶液)，用GBSS稀释。例如实验中要用到的17.6％碘克沙醇和11.5％碘克沙醇，怎样配置？以配制50ml为例

17.6％：取optiPrep(17.6％×50ml)÷60％＝14.667ml，取GBSS 50ml－14.667ml＝35.333ml

4.小鼠灌注

灌注开始前，需要先将EGTA灌注液，消化酶都提前预热。水浴锅提前加热至42℃，提前预热灌注液和酶。使用蠕动泵灌注，灌注速度5ml/min是合适的速度。很多蠕动泵不是写的多少ml/min，可以自己先试一下大概5ml/min的转速就是合适的速度。

4.1异氟烷麻醉，用75％酒精喷腹部消毒。开腹做u型切口将皮肤掀开，可以避免沾上鼠毛。

4.2将胃肠等腹腔内器官扒开，暴露门静脉和下腔静脉。推荐采用24G留置针，头皮针也可不过容易扎穿血管。可以采用门静脉插管，剪开下腔静脉。这个方法存在的问题是门静脉比较细不容易进针。也可以采用下腔静脉插管，剪开门静脉的逆行灌注的方法。这个方法的问题是需要夹闭肝上下腔静脉，夹闭的时候很容易引起肝脏瘀血，后期冲不干净，先剪开门静脉再夹闭肝上下腔镜脉可能会有血干扰视野。实际操作中可以自己选择合适的方法两者均可，我个人习惯门静脉进针。建议带线将针固定在血管上，可以避免后期滑落，滑掉之后就很难再进针了。

4.3消化

一般如果进针没问题，可以保证有效灌注，将配好的EGTA和酶灌完即可。EGTA 一般灌注15ml，如果血液没冲干净可以适当多灌一点。换灌注液的时候需要暂停蠕动泵，避免空气进去管道。空气灌进去之后，一者会损伤细胞，二者会影响小分支末端的灌注。灌注的过程中也需要关注保证管道末端处于灌注液水平面以下，因为随着灌注液的减少，离心管会在水浴锅里飘起来可能会进入空气。

4.4消化的终点

一般消化良好，可以看见包膜下有裂纹。这个不好描述，可以看附件。

二、细胞分离

1.取肝

先剪开门静脉，避免有血液进去肝脏。用镊子轻轻拎起肝门Glisaon鞘，剪开膈肌离断肝上下腔静脉，并分离肝脏与胃、肾及周围其他器官治疗的韧带和结缔组织。注意避免肝包膜的破损，容易导致后期的细菌污染。尤其是后续如果培养肝细胞，非实质细胞因为要反复离心，可能影响会小一些。下肝时建议换一把剪刀和镊子，不要用开腹时用的剪刀和镊子。

2.取下肝脏后，将肝脏放在4℃的DMEM中，后续的分离操作建议在超进化操作。所使用的GBSS等溶液都需要4℃预冷。先将肝脏轻轻在DMEM中洗一下，去掉表面可能沾上的鼠毛等污染物。取一个新的50ml离心管，加入5mlDMEM，将肝脏转移到新的DMEM中

3.接下来是撕开肝包膜，游离细胞的操作。可以在小皿中操作，也可以在50ml离心管中操作。用镊子轻轻撕开肝包膜，用5ml巴氏管轻轻的搅动以促进细胞的游离。后续的移液操作均建议使用巴氏管操作，移液枪tip口径太小容易造成细胞的机械损伤。消化较好的肝脏细胞很容易就游离下来，只剩下包膜。游离下来的细胞悬液，过70um细胞筛。加入5mLGBSS轻轻冲洗细胞筛，以收集细胞筛上残留细胞。

4.加入GBSS补充到50mL，50g离心5min。上清液中主要是非实质细胞，沉淀主要是肝细胞。很多文章都是建议三次50g离心去除上清液中残余肝细胞。因为我需要的是肝窦内皮细胞，所以我没有进一步50g离心。用50mL GBSS重悬肝细胞，50g离心5min，收集上清液。相当于洗涤一次肝细胞，进一步收集里边混合的非实质细胞，有文章报道可以提高30％肝窦内皮细胞产量。收集第一次离心的上清液和第二次离心的上清液，400g离心5min，收集沉淀即为非实质细胞。

5.收集上步中得到的肝细胞重悬，并将肝细胞悬液加到25％percoll上。1250g离心5min。这一步是为了去除活性不好的肝细胞，活性不好的细胞会漂浮在上层。用肝细胞培养基(10％FBS DMEM)重悬肝细胞，选用合适浓度铺板。4小时后，用预热的PBS洗一遍，去除未贴壁的细胞。我不是做肝细胞的，提原代肝细胞的建议去看另外一个师兄的帖子，写的非常好。下边是链接https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/42109000?sf=1&sr=1

6.分离肝窦内皮细胞、kupffer细胞、肝星状细胞

取第4步收集的非实质细胞，用4ml 17.6％碘克沙醇溶液重悬，用巴氏管轻轻重悬。在细胞悬液上方加入4ml 11.5％ 碘克沙醇，用注射器贴着15ml离心管壁缓慢加入，注意不能破坏分层。最后，在11.5％碘克沙醇上方加入2ml DMEM培养基。

在冷冻离心机4℃，1400g离心20min，确保0制动0加速。

离心结束后，HSC位于11.5％碘克沙醇和DMEM之间的界面，LSEC和KC位于17.6％和11.5％碘克沙醇界面之间。

巴氏管轻轻吸取HSC以及KC和LSEC混合物，用GBSS轻轻重悬。400g离心5min，HSC沉淀可以立即铺板（提前用鼠尾基质胶包被可以抑制HSC的自发性激活）。LSEC和KC需要在CD146磁珠下进一步分离纯化。

7.LSEC纯化

这里需要用到CD146磁珠，我买的是美天尼的，似乎好像只有美天尼才有。需要先配置一个MACS buffer，

MACS BSA stock solution:auto MACS rinsing buffer＝1:20

取LSEC和KC混合沉淀，用180uL MACS buffer重悬，切记用巴氏管重悬，开始就提到了所有的移液重悬推荐使用巴氏管。加入20uL CD146 beads，4℃冰箱避光孵育15min。

孵育的同时，用500uL MACS buffer润洗MS collum。

孵育结束后，用500uL MACS buffer 轻轻吹打，然后在磁力架上过MS collum柱，收集过完柱子的液体，里边主要是KC，根据实际操作来看，里边还有大量红细胞。等柱子中液体流完以后，在用500uL MACS buffer 清洗三遍。

将柱子从磁力架取下，放在15mL离心管上，加入MACS buffer 用活塞推出LSEC细胞。

400g/5min，离心LSEC和KC组分。

KC培养在10％FBS DMEM培养基中

LSEC培养在(10％FBS+5ml ECGS Sciencell公司+1％PS)

提前用鼠尾机制胶包被可以促进LSEC的贴壁和抑制LSEC的毛细血管化。

下图是分离后第三天的LSEC

已经尽量写的很仔细了，附件有参考文献，小鼠消化的图片，密度梯度离心的图片以及原代细胞图片，包括免疫荧光鉴定的结果。