多肽合成中保护基的研究进展

摘要 本文介绍了近年发展起来的30多种氨基酸的保护基及其导入和脱去方法，应在多肽合成中，显示出更高的选择性，有利于减少副反应和提高产率。

从本世纪初，人们就试图化学合成具有生物活性的多肽，直到50年代以后，由于发现了几种具有重要意义的保护基团，建立了各种肽键形成方法，改进了分离纯化技术，才有可能人工合成一系列活性多肽和蛋白质。而后，选择性保护和脱保护问题一直是一个活跃的研究领域。Bodanszky等曾对各种氨基酸保护基作过详尽的论述，本文主要介绍近年来多肽合成中保护基的一些进展。

1 α-氨基保护基

在多肽合成中，α-氨基保护基的数目已多于150个，按其结构可分为烷氧羰基、酰基和烷基等，其中为数最多最常用的是取代烷氧羰基类，如苄氧羰基(Z)、叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)等。通过改变这些保护基的化学结构，可以改变它们对酸、碱或氢化等条件的稳定性或敏感性，得到选择性更高的α-氨基保护基(表1)。

其中，β-苯乙氧羰基比苄氧羰基多一个碳单位，故称之为同苄氧羰基(hZ),与Z类似，可经催化氢化脱去，用新制备的10%钯炭效果最佳。但是，hZ对氢溴酸和三氟乙酸(TFA)的稳定性比Z高。β-(4′-吡啶)乙氧羰基(4-Pyoc)保护的氨基酸水溶性良好，使肽合成可在水中进行。4-Pyoc对TFA和催化氢化稳定，可与叔丁基或苄基(Bzl)合用制备多肽，脱去时需先N-甲基化，再加吗啡啉。

3,5-二叔丁基苯异丙氧羰基对碱和催化氢化稳定，用TFA脱去的酸解速度比Boc快4000～8000倍，而3,5-二叔丁基苄氧羰基的酸解速度比Boc慢。1,3-二溴叔丁氧羰基用于保护α-氨基制备多肽，对酸稳定，易在甲醇或乙醇中加热脱去。N-二苯膦酰基(Dpp)在碱水解甲酯和催化氢化苄酯的条件下不受影响，既可用于保护氨基，又能用于活化羧基，脱去条件很缓和，用稀酸如HCl/二氧六环-水(15:2,v/v,0.7mol/L)处理数小时即可，因此可以避免脱保护基时烷基化等副反应。

2 α-羧基保护基

不需要活化接肽的氨基酸α-羧基多用叔丁酯、苄酯和对甲氧苄酯等保护，近年来报道的羧基保护基比较多，绝大多数也是取代烷基酯(表2),有的也可形成取代酰肼或金属盐(如三价钴盐)进行保护。

表2中的羧基保护基对酸均稳定，但有些可用碱皂化脱去。多肽在强碱性条件下是不稳定的，所以，皂化脱保护的碱性越弱越好。卤代乙基因β-位吸电子卤素的存在而易被硫离子亲核取代，在Na₂S条件下，N-Boc和Z以及多肽都是稳定的。

9-芴甲基(Fm)、β-(2-吡啶)乙基(Pet)和烯丙基(All)作为羧基保护基，越来越多地应用于多肽合成中。它们与相应的氨基保护基Fmoc、4-Pyoc和Alloc具有类似的稳定性，脱去条件也同样缓和，而且都有紫外吸收，便于检测。但有甲硫氨酸和组氨酸存在时，不能使用Pet。氨基酸的4-磺酸苄酯比相应的苄酯增加了溶解度和稳定性，脱去氨基保护的4-磺酸苄酯以双离子形式存在，易于重结晶和用离子交换层析分离纯化。β-二苯膦乙基(Dppe)和2′-(1,3-二噻烷)甲基(Dim)酯在一般多肽合成条件下稳定，当P-甲基化和S-氧化后，对弱碱性非常敏感，易于脱去而不影响Boc和Z等其它保护基。

3 侧链保护基

为了避免多肽合成中的副反应，常需用适当的保护基将氨基酸侧链上的化学活性基团保护起来。天冬氨酸的β-羧基若以苄酯或叔丁酯保护，缩合而成的保护肽在酸、碱条件下易环化产生丁二酰亚胺衍生物，进一步水解为难以分离的β-肽。用烯丙基保护β-羧基，在用吗啡啉脱去条件下没有环化副反应，但用过量的三乙胺处理，仍会产生环酰亚胺。β-环烷醇酯、金刚烷醇酯和薄荷醇酯都比苄酯稳定，可以减少天冬氨酸肽的环化副反应，薄荷醇酯在抑制碱催化丁二酰亚胺形成方面是目前效果最好的，这些保护基用强酸HF或CH₃SO₃H等脱去，二苯硫醚可协助脱去。

在使用强酰化剂或羧基组分过量的多肽合成中，需要保护侧链羟基。用2′-甲氧基乙氧甲基保护丝氨酸等羟基，对TFA的稳定性比苄基和叔丁基高，脱Boc时不受影响，但可用HCl/TFA(2mol/L)或者HBr/CH₃COOH脱去。N-Boc保护的酪氨酸羟基，用二甲膦酰基保护，对氢解和TFA稳定，在三乙胺或20%NH₂NH₂的甲醇溶液中脱去。

保护半胱氨酸的侧链巯基，一般是形成三苯甲基或对甲氧苄基等的硫醚，以防止巯基酰化和氧化等副反应。S-1-金刚烷基比对-甲氧苄基还稳定，硫不易被氧化形成亚砜，用TFA脱N-对甲氧基苄氧羰基时不受影响，可用三氟甲基磺酸(TFMSA)-苯甲硫醚(PhSCH₃)/TFA(1mol/L)脱去，三甲基苯基硫硅烷〔Ph-S-Si(CH₃)₃〕是亚砜的有效还原剂。

组氨酸(His)极易消旋，因其咪唑基π-氮原子上孤对电子参与的结果，保护N(t)的His仍会发生严重的消旋化。当用一氯化物导入N(π)-苄氧甲基(Bom)或叔丁氧甲基(Bum)进行保护时，则完全抑制His在多肽合成中的消旋化副反应。Bom对碱和TFA稳定，可经催化氢化或HBr/TFA脱去，Bum对碱和氢化稳定，需用TFA脱去。

近年来，多取代苯磺酰基越来越多地用于保护色氨酸(Trp)的吲哚环〔N(in)〕、精氨酸(Arg)的胍基〔N(G)〕和赖氨酸(Lys)的末端氨基〔N(o)〕等(表3)。这些侧链保护基都由相应的磺酰氯导入，对氢化稳定，而对酸和碱的稳定性差别较大，一般按表3中的次序由上至下递增，脱去所需要的酸性也相应地依次增强。其中对酸稳定性高的2,4,6-三异丙基苯磺酰基(Tps)、2,4,6-三甲基苯磺酰基(Mts)、五甲基苯磺酰基(Pme)和2,4,6-三甲氧基苯磺酰基(Mtb)等均可用于TFA处理的肽合成过程中；而对酸稳定性较差的2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、9-蒽磺酰基(Ans)和4-甲氧基-2,5,6-三甲基苯磺酰基(Mtr)等均可用于无TFA处理的过程中，如与N(a)-Fmoc合用。这些取代苯磺酰基能有效地防止在多肽合成中Trp吲哚环的氧化、分解和修饰以及由Arg胍基或Lysw-氨基引起的副反应，有时加入乙二硫醇等辅助脱去剂时效果更好。

4 保护基的导入与脱去

早期应用重要的氨基保护基导入试剂如Boc-N₃、Z-Cl和Fmoc-Cl等均具有不稳定、毒性大和副反应较多等缺点，而相应的活化酯如1-羟基苯并三氮唑(HOBt)酯、五氟苯酚酯、对硝基苯酚酯、2-羟基吡啶酯和1,2,2,2-四氯乙醇(TCE)酯等均易制备、稳定性好、便于贮存，用于导入氨基保护，反应快、产率高。对称酸酐如(Boc)₂O,Z₂O(S)和(Alloc)₂O等也都是良好的导入试剂。

羧基保护基的导入，多用N-保护氨基酸在碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶催化下与保护基醇直接成酯，如Fm、Pet和Dppe等。也可用氨基酸盐与卤代烃反应成酯，如烯丙基和4-磺酸苄基等。用(Ph₂CHO)₂PO,Ph₂-CHOP(O)(OPh)₂或Ph₂C-N=N/(PhO)₂-POH等试剂可在丝氨酸和酪氨酸的羧基和侧链羟基上同时导入二苯甲基，速度快、产率高。在室温下用HCl/CH₃COOH处理30min,选择性脱去羧基保护基，保留羟基保护基，后者需经催化氢化脱去。

常用的脱保护方式是酸解和氢解，占总脱保护反应的80%以上。有时也用碱解、氧化还原和亲核取代等反应。理想的脱保护反应需具有选择性强、不损害肽链、不引起副反应和不改变光学活性等条件。

根据保护基的稳定性，可以选用不同强度的酸 如TFA,HCl/CH₃COOH,HBr/CH₃COOH,HF,CH₃SO₃H和TFMSA等进行选择性脱去，加入一些辅助脱去剂如苯甲醚、苯甲硫醚、五甲基苯和4-甲硫基酚等，可以加快酸解速度，减少烷基化等副反应的发生。高浓度的HF或TFMSA以SN1脱保护反应为主，产生的正碳离子易带来副反应。用二甲硫醚稀释至较低浓度时，则转变为SN2反应，抑制了烷基化副反应。

N-保护的氨基酸及其活化形式如对称酸酐和2,4-二硝基酚酯，能够在三氟乙醇中脱去酸敏的N-联苯异丙氧羰基和三苯甲基等保护基，既作脱去剂，又作酰化剂。其反应式如下：

用钯等催化氢解，是比较缓和的脱保护方式。一些可氢解脱去的保护基如NO₂,Z,hZ和Bzl等，可在中性条件下用HCOONH₄/Pd-C转移氢化脱去。在2%PdCl₂(PPh₃)₂催化下，用(n-C₄H₉)₃SnH氢化脱烯丙氧羰基和烯丙基的条件，不影响苄氧羰基和苄基，选择性很高。

5 结 语

总之，多肽合成离不开保护基团。本文中介绍的新保护基，尤其是一些含有氮、硫或磷元素的保护基，其稳定性、溶解性和脱去条件都具有一定的特色，选择性高，日益广泛地应用于多肽合成中，必将推动多肽合成化学更快地向前发展。

免责声明：本文为行业交流学习，版权归 原作者所有，如有侵权，可联系删除。