西综笔记-生物化学-DNA 重组和重组 DNA 技术

一、工具酶

1. 常用工具酶

限制性核酸内切酶（Ⅱ 类）：识别 DNA 特异回文序列并在识别位点切割，不切割细菌自身 DNA（通过甲基化酶修饰保护自身），用于重组 DNA 技术。

DNA 连接酶：连接双链 DNA 单链缺口，催化形成 3',5'- 磷酸二酯键，用于冈崎片段连接及目的基因与载体连接。

逆转录酶：以 mRNA 为模板合成 cDNA，用于目的基因合成（如 RT-PCR 技术）。

Klenow 片段：原核生物 DNA 聚合酶 Ⅰ 水解产物，保留 5'→3' 聚合酶活性及 3'→5' 外切酶活性，用于合成 cDNA 第二链、双链 DNA 3' 末端填补及标记。

其他：DNA 聚合酶 Ⅰ、多聚核苷酸激酶、末端转移酶（3'- 羟基末端同质多聚物加尾）、碱性磷酸酶（水解核酸 5' 末端磷酸）。

2. 非工具酶

拓扑异构酶（参与 DNA 复制中松弛超螺旋）、解螺旋酶（DNA 复制解链）、RNA 聚合酶（转录过程），均不用于重组 DNA 技术。

二、目的基因获取方法

逆转录合成（RT-PCR）：逆转录与 PCR 联合，从 RNA 获取目的基因，合成的 cDNA 不含内含子，可直接转入原核生物表达。

化学合成法：已知目的 DNA 全序列时，通过 DNA 合成仪直接合成。

从基因文库获取：已知部分序列时，从基因组文库（含内含子）或 cDNA 文库（不含内含子，由 mRNA 反转录而来）筛选。

PCR 扩增：已知目的 DNA 两端序列，设计引物扩增获取。

三、克隆载体

1. 类型

常用载体：质粒 DNA（细菌染色体外双链环状 DNA，能自主复制，携带目的基因进入受体细胞）、噬菌体 DNA、病毒 DNA。

大容量载体：柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体。

2. 基本条件

核心条件：能自主复制（自我复制功能）。

其他条件：有选择标志（如抗生素抗性基因）、有限制性核酸内切酶单一切点。

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3. 非载体 DNA

大肠杆菌染色体 DNA 不具备自主复制、选择标志及单一酶切位点，不能作为克隆载体。

四、技术概念

转染：外源 DNA 导入真核细胞（酵母除外），如用质粒将外源 DNA 转入动物细胞。

转化：外源 DNA 导入原核细胞（如大肠杆菌），如电穿孔法导入。

感染：用病毒载体将外源 DNA 导入细胞（包括原核 / 真核）。

黏性末端连接：同一限制性核酸内切酶切割目的基因与载体，产生互补黏性末端，通过碱基配对及 DNA 连接酶催化连接。

五、重组体筛选方法

遗传标记筛选：利用载体遗传标记（如抗生素抗性、插入失活 / 表达特性、标志补救、噬菌体包装特性）筛选。

序列特异性筛选：限制性内切酶酶切法、PCR 法、核酸分子杂交法、DNA 测序法。

亲和筛选：特异性抗体与目的基因表达产物结合的免疫学筛选。

六、应用

重组DNA技术在医学领域的应用主要用于基因工程药物研发。