植物叶绿体基因组|解析苦木的叶绿体基因组：结构、变异性及进化关系

解析苦木（Picrasma quassioides）的叶绿体基因组：结构、变异性及进化关系

Decoding the Chloroplast Genome of Bitterwood (Picrasma quassioides): Structure, Variability, and Evolutionary Relationships

时间：2025 杂志：Ecology and Evolution 影响因子：2.3 分区：2/2区

摘要

苦木（Picrasma quassioides）是亚洲传统医学中具有重要药用价值的植物。为了解其遗传结构以及在苦木科内的进化关系，本研究对苦木的叶绿体基因组进行了测序和分析。高通量测序结果显示，苦木叶绿体基因组为一个长度为 160,013 bp 的环状分子，具有典型的四分体结构，共编码 132 个基因，包括 87 个蛋白质编码基因、37 个转运 RNA（tRNA）基因和 8 个核糖体 RNA（rRNA）基因。通过与其他苦木科植物的比较分析，发现了单拷贝区和重复区核苷酸多样性的差异模式，同时对反向重复（IR）边界的研究揭示了其动态的进化过程。对 101 个简单序列重复（SSR）位点和 48 个重复序列的分析，为基因组组织研究提供了见解，并筛选出潜在的物种鉴定分子标记。对 78 个蛋白质编码基因的选择压力分析表明，净化选择占主导地位（平均Ka/ Ks比值为 0.23），但部分基因存在正选择的证据。基于 77 个蛋白质编码序列的系统发育重建，证实了苦木科的单系性，并揭示了其与芸香科的紧密进化关系。这些发现不仅推进了我们对苦木科叶绿体基因组进化的理解，还为这种珍贵药用植物的鉴定和育种提供了分子工具。综合的基因组特征分析，为研究苦木药用特性的遗传基础和保护策略提供了基础。

材料与方法

2.1 植物材料、DNA 提取与测序

从中国广西壮族自治区喀斯特地貌的成熟苦木个体（n = 5）上采集新鲜叶片（23°06′N，107°03′E；海拔 450 米）。由于研究未涉及濒危或保护物种，且采样地点不在保护区内，因此无需特殊许可。标本（HZ2022 - 05）由朱灿生博士鉴定，并保存于广西林业科学研究院植物标本馆。采用改良的 CTAB 法，从硅胶干燥的叶片中提取基因组 DNA，并加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP - 40）以去除多酚（Yang 等人，2014），随后用 RNase A（Thermo Scientific）处理。通过 1% 琼脂糖凝胶电泳（120 V，45 分钟）验证 DNA 完整性，使用 NanoDrop OneC 分光光度计测定纯度（A260/A280 = 1.82 ± 0.03；A260/A230 = 2.15）。

全基因组测序由深圳市惠通生物科技有限公司（中国，深圳）在 Illumina NovaSeq 6000 平台（美国加利福尼亚州圣地亚哥 Illumina 公司）上进行，构建插入片段大小为 350 bp 的 150 bp 双端文库。初始测序产生了 6412 万条原始 reads（总计 9.62 Gb 数据），使用 Trimmomatic v0.33 软件（Bolger 等人，2014）进行质量过滤，参数设置为：SLIDINGWINDOW:4:20，MINLEN:50。经过过滤后，保留了 5964 万条高质量 reads 用于后续分析。

2.2 叶绿体基因组组装与注释

使用 GetOrganelle v1.7.1 软件（Jin 等人，2020），对 5 个个体的叶绿体基因组分别进行独立组装，k - mer 参数采用默认值（k = 21、45、65、85、105）。组装得到的序列长度均为 160,013 bp，使用 MAFFT v7.487 软件（Katoh 和 Standley，2013）进行比对，以评估种内变异，结果发现个体间无核苷酸差异。因此，选取其中一个代表性序列（来自标本 HZ2022 - 05 - 01）进行详细分析。利用 CPGAVAS2 平台（Liu 等人，2012），以臭椿（Ailanthus altissima）叶绿体基因组（GenBank 登录号：NC_037696.1）为参考，进行基因组注释。使用 Geneious Prime v2023.2.1 软件（Kearse 等人，2012）对注释结果进行手动校正。利用 Chloroplot（Zheng 等人，2020）软件，并调整 GC 偏斜度，对注释后的基因组结构进行可视化。完整的叶绿体基因组序列已提交至 GenBank 数据库（登录号：NC_067857.1）。

2.3 相对密码子使用和重复序列分析

使用 CodonW v1.4.2 软件（Sharp 等人，1986）计算 87 个蛋白质编码基因（PCGs）的相对同义密码子使用（RSCU）值。利用 REPuter v3.0 软件（Kurtz，2001）识别四种重复类型，参数设置为：汉明距离 = 3，最小重复长度 = 30 bp，E值≤1e - 5。通过 MISA v2.1 软件（Beier 等人，2017）检测简单序列重复（SSRs），单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸的最小重复阈值分别设定为 10、5、4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最小重复阈值均为 3。

2.4 叶绿体基因组比较分析

利用 IRscope 软件（Amiryousefi 等人，2018），对 7 种苦木科植物（苦木（NC_067857.1）、长叶宽果苦木（Eurycoma longifolia，MH751519.1）、臭椿（NC_037696.1）、佛罗里达莱氏树（Leitneria floridana，NC_030482.1）、变色苦木（Simarouba versicolor，NC_088060.1）、苦树（Simarouba amara，NC_085162.1）和鸦胆子（Brucea javanica，NC_063730.1））的 IR 区域动态变化进行分析。使用 DnaSP v6 软件（Rozas 等人，2017）评估核苷酸多样性（π），采用 600 bp 滑动窗口，步长为 200 bp，以评估叶绿体基因组的变异性。

2.5 选择压力分析

使用 KaKs_calculator v3.0 软件（Zhang，2022），对 7 种苦木科植物共有的蛋白质编码基因进行选择压力分析。通过两两比较计算同义替换率（Ks）和非同义替换率（Ka）。判断标准遵循常规阈值：Ka/Ks > 1 表示正选择，Ka/Ks = 1 表示中性选择，Ka/Ks < 1 表示净化选择。

2.6 系统发育分析

为确定苦木在无患子目（Sapindales）中的系统发育位置，我们分析了 41 个完整的叶绿体基因组（包括 7 种苦木科植物），并以人参（Panax ginseng）和三七（Panax notoginseng）（五加科）作为外类群。使用 MAFFT v7.487 软件（Katoh 和 Standley，2013）对 77 个共享的蛋白质编码基因进行比对。利用 Gblocks v0.91b 软件（Talavera 和 Castresana，2007）去除比对效果不佳的区域。在 IQ - TREE v1.6.12 软件（Minh 等人，2020）中，采用最大似然法进行系统发育重建，使用 ModelFinder（Kalyaanamoorthy 等人，2017）选择的 GTR + F + R3 替代模型。通过 5000 次超快自展检验评估树的稳健性，最终的系统发育树使用 Chiplot 在线工具（ https://www.chiplot.online/ ）进行可视化。

结果

3.1 苦木叶绿体基因组的结构特征

图 1a 展示了苦木的形态，包括其叶片和果实。苦木完整的叶绿体基因组组装后，被确定为一个环形 DNA 分子，总长度为 160,013 bp（图 1b）。它具有被子植物叶绿体基因组典型的四分体结构，由一个大单拷贝区（LSC）（87,129 bp，占 54.45%）、一个小单拷贝区（SSC）（18,072 bp，占 11.29%）和两个反向重复区（IR）（每个 27,406 bp，共占 34.26%）组成。

图 1 苦木的形态和叶绿体基因组图谱（a）苦木叶片和果实的照片（b）苦木叶绿体基因组的环形图谱。最外层的圆圈展示了基因图谱，基因根据其功能类别进行颜色编码。内层圆圈描绘了基因组区域：大单拷贝区（LSC）、小单拷贝区（SSC）以及两个反向重复区（IRA 和 IRB）。灰色的内层圆圈表示整个基因组的 GC 含量。基因组的总大小和 GC 含量显示在图谱的中心位置。

对不同区域核苷酸组成的分析表明，基因组存在显著的结构异质性（表 1）。总体 GC 含量为 37.97%，但基因组内部存在较大差异。具体而言，IR 区域的 GC 含量最高（42.67%），这主要是由于 rRNA 基因簇的富集。相比之下，SSC 区域的 GC 含量最低（32.41%）。在蛋白质编码序列（CDS）中，GC 含量在密码子的不同位置呈现分层现象。第一个密码子位置的 GC 含量最高（45.76%），而第三个位置的 GC 含量最低（31.17%）。这种模式与在翻译限制较少的位点上，选择偏好富含 AT 的同义密码子的压力一致。

表 1 苦木叶绿体基因组不同区域的核苷酸组成

基因组注释共鉴定出 132 个功能基因，包括 87 个蛋白质编码基因、37 个转运 RNA（tRNA）基因和 8 个核糖体 RNA（rRNA）基因（表 2）。进一步的基因结构分析揭示了复杂的内含子模式。16 个基因含有单个内含子，包括ndhA、ndhB、petB、petD、atpF、rpl16、rpl2、rps12、rps16、rpoC1、trnA - UGC、trnG - UCC、trnI - GAU、trnL - UAA、trnK - UUU和trnV - UAC。两个基因（clpP和ycf3）含有两个内含子。其余基因则完全没有内含子序列，这表明叶绿体基因在剪接需求和功能限制方面存在系统发育差异。

表 2 苦木叶绿体基因组的基因组成和组织

注：Gene*：含有一个内含子的基因；Gene**：含有两个内含子的基因；Gene (2)：多拷贝基因的拷贝数。

3.2 重复元件和简单序列重复分析

对苦木叶绿体基因组的分析显示，存在 101 个简单序列重复（SSRs），这些 SSR 具有不同的组成和长度特征（图 2a）。单核苷酸重复，主要是 poly - A/T 重复，是最丰富的 SSR 类型（占 72.28%，73/101），重复单元长度在 10 - 16 之间。二核苷酸 SSR 占 10.89%（11/101），主要由 AT/TA 基序组成（9 个位点），重复单元数为 5 - 7。三核苷酸至六核苷酸重复占 SSR 总数的 16.83%（17/101），重复单元数为 3 - 5。富含 A/T 的 SSR 的优势与基因组整体的 AT 偏好（62.03%）相符，表明它们可用作群体遗传学和物种鉴定的分子标记，对于保护这种具有重要药用价值的物种尤为重要。

综合重复序列分析共鉴定出 47 个不同的重复元件，分为四种类型：正向重复（F）、反向重复（R）、互补重复（C）和回文重复（P）（图 2b）。这些重复序列大多长度在 30 - 60 个碱基对之间。回文重复是最常见的类型，出现了 23 次。正向重复次之，出现了 19 次。反向重复和互补重复较少见，长度通常在 30 - 32 个碱基对之间。

图 2 苦木叶绿体基因组中重复元件的分布和特征：（a）按重复类型和重复单元大小划分的简单序列重复（SSRs）频率分布，（b）按重复类型分类的长重复序列定量分析（C：互补重复；F：正向重复；P：回文重复；R：反向重复）及长度分布。

3.3 蛋白质编码基因的密码子使用偏好模式

密码子使用分析表明，苦木叶绿体基因组存在显著的非随机偏好，相对同义密码子使用（RSCU）值可证明这一点（图 3）。在多个氨基酸的密码子使用上观察到明显偏好。例如，精氨酸密码子 AGA 和 CGU 的使用频率显著高于其同义密码子 AGG 和 CGG（RSCU 值分别为 1.77 和 1.19，而 AGG 和 CGG 的 RSCU 值分别为 0.67 和 0.52）。甘氨酸也有类似模式，GGA 的 RSCU 值（1.6）显著高于 GGC（RSCU 值为 0.4）。同样，亮氨酸密码子 UUA 和 CUC 的使用频率较高（RSCU 值分别为 1.79 和 1.23），而 CUG 的使用频率较低（RSCU 值为 0.44）。在终止密码子中，UAA 是主要使用的终止密码子。这些密码子使用模式的系统变化表明，特定的选择压力在塑造叶绿体基因组的蛋白质编码区域。这些偏好可能反映了与 tRNA 可用性的共同进化，提高了对光合作用和细胞器功能至关重要的叶绿体基因的翻译效率，进而间接支持植物的生理过程（Parvathy 等人，2022）。

图 3 苦木叶绿体基因组的密码子使用偏好分析。图中展示了每个密码子的相对同义密码子使用（RSCU）值，该值表示在同义密码子使用均等假设下，观察到的密码子使用频率与预期频率的比值。RSCU 值大于 1 表明该密码子具有优先使用性，而小于 1 的值则表示其使用频率低于基于同义密码子频率均等的预期值。

3.4 反向重复（IR）区域边界的比较分析

对 7 种苦木科植物叶绿体基因组的反向重复（IR）连接边界进行比较研究，发现其具有保守的进化模式，但也存在物种特异性的结构修饰（图 4）。完整的叶绿体基因组大小变化有限（佛罗里达莱氏树为 158,736 bp，臭椿为 160,815 bp），尽管边界位置有所变化，但仍保持保守的四分体结构。JLB 连接点（LSC/IRb 边界）在种间差异显著，主要位于 rpl22 编码区域内，但向 IRb 区域的延伸长度不同（臭椿为 5 bp，长叶宽果苦木为 255 bp）。值得注意的是，鸦胆子的 JLB 位置与其他物种不同，位于 rps3 基因内，rpl22 位于边界上游 89 bp 处。

在 JSB 连接点（SSC/IRb 边界），所有类群均与假基因化的 ycf1 序列相交，尽管 SSC 区域的插入深度存在一定差异（6 - 55 bp），但仍呈现出保守模式。相比之下，JSA 连接点（SSC/IRa 边界）的可塑性更强，ycf1 基因向 IRa 区域的延伸长度在 1168 - 1332 bp 之间。JLA 连接点（IRa/LSC 边界）呈现出三种结构构型：第一类物种（苦木、长叶宽果苦木、臭椿）将边界定位于 rps19 和 trnH 之间；第二类物种的连接点位于 rpl22 基因内，且 LSC 区域有不同程度的延伸（0 - 189 bp）；而鸦胆子（第三类）的边界独特地位于 rpl22 - trnH 基因间隔区，rpl22 与边界之间保持 89 bp 的距离，这一特征在其他研究物种中未发现。这些边界变化表明，苦木科内 IR 区域的扩张 / 收缩过程受到不同的进化约束。

图 4 7 种苦木科植物叶绿体基因组反向重复（IR）边界的结构比较。该图展示了四个关键连接点：LSC/IRb（JLB）、IRb/SSC（JSB）、SSC/IRa（JSA）和 IRa/LSC（JLA）。方框内的数字表示基因末端与边界位置之间的距离（以碱基对为单位）。箭头表示跨越这些边界的基因的相对位置和方向。

3.5 核苷酸多样性模式分析

对 7 种苦木科植物叶绿体基因组的核苷酸多样性进行比较分析，揭示了不同的序列变异模式（图 5）。多序列比对及随后的核苷酸多态性分析表明，序列保守性存在区域异质性，单拷贝区和重复区之间差异明显。

全基因组核苷酸多样性（π）范围为 0 - 0.089，平均值为 0.025。从结构上看，大单拷贝（LSC）区和小单拷贝（SSC）区的序列变异性明显高于更为保守的反向重复（IR）区。鉴定出多个核苷酸多样性较高（π>0.075）的基因组热点区域，包括基因区和基因间隔区。这些热点区域包括 ycf1 基因区域、rpl32 基因区域以及几个基因间隔区（rps16 exon1 - trnQ、rpl32 - trnL、ndhF - rpl32 和 psbZ - trnG）。SSC 区域内的 ycf1 区域尤为突出，显示出多个高序列变异位点。这表明该区域有可能作为苦木科内进化研究和物种鉴别的分子标记。

图 5 7 种苦木科植物叶绿体基因组的核苷酸多样性分析。该图展示了核苷酸多样性（π）值，峰值对应特定的基因和基因间隔区域。x 轴表示比对序列的位置，y 轴显示使用滑动窗口法计算得到的核苷酸多样性值。峰值表示高序列变异性区域，而谷值代表保守区域。值得注意的核苷酸多样性值较高的区域已标注。

3.6 苦木科叶绿体基因的选择进化压力分析

对 7 种苦木科植物的选择压力进行比较分析，揭示了叶绿体蛋白质编码基因不同的进化约束模式（图 6）。以苦木叶绿体基因组为参考，对 78 个共享的蛋白质编码基因的非同义替换率（Ka）与同义替换率（Ks）的比值进行了研究。

分析结果显示，所有研究基因的平均 Ka/Ks 比值为 0.23，表明整个叶绿体基因组主要受到纯化选择的影响。这一观察结果表明，大多数叶绿体基因受到强烈的进化约束，以维持其功能的保守性。然而，也发现了一些具有不同进化模式的特定基因。最显著的是，长叶宽果苦木中的 psbJ 基因和佛罗里达莱氏树中的 rpl20 基因的 Ka/Ks 比值超过 1.0，表明这些基因经历了正选择。其余基因的 Ka/Ks 比值始终低于 1.0，证实了纯化选择是苦木科叶绿体基因组中主要的进化驱动力。这种选择压力模式表明，大多数叶绿体基因维持着在物种间高度保守的基本功能，同时允许特定基因偶尔发生适应性进化。

图 6 苦木科叶绿体基因选择压力的分布。该图展示了苦木与其他 6 种苦木科植物共享的 78 个蛋白质编码基因的 Ka/Ks 比值。

3.7 系统发育分析与进化关系

基于 41 个物种叶绿体基因组中的 77 个共享蛋白质编码基因，进行了全面的系统发育分析，以阐明无患子目内的进化关系（图 7）。分析包括 39 种无患子目植物和 2 种五加科植物（人参和三七）作为系统发育外类群。所得的最大似然（ML）树显示出清晰的进化关系，所有主要分支的自展支持值均超过 90%，支持力度较强。

系统发育重建结果清晰地显示了无患子目和伞形目之间的目级分化，树形拓扑结构分为两个主要分支和五个不同的子分支。每个子分支都获得了最大的自展支持（100%），表明对恢复的科级关系具有高度的置信度。在此框架内，分析揭示了不同分类水平上的几个重要进化模式。

在科级水平上，苦木被明确归为苦木科分支，与臭椿、鸦胆子、佛罗里达莱氏树、长叶宽果苦木、苦树和变色苦木具有密切的进化关系。此外，分析还揭示了苦木科与芸香科之间尤为密切的进化关系，最大自展值为 100%。这种姐妹群关系比与其他无患子目科（如橄榄科、漆树科和楝科）的关系得到了更强的支持。

图 7 基于叶绿体蛋白质编码基因的无患子目分子系统发育树。该最大似然树由 41 个物种的 77 个蛋白质编码序列构建而成，其中包括 39 种无患子目植物和 2 种五加科外类群。节点处的数字表示 5000 次重复的自展支持值。苦木（用红星标记）在无患子目主要谱系中的位置如图所示。

结论

本研究对苦木叶绿体基因组进行了全面分析，揭示了苦木科内既存在保守的结构特征，也存在动态的进化模式。通过识别可变区域和选择压力，我们确定了分子进化的模式，同时证实了苦木科的单系性及其与芸香科的进化关系。这些基因组学见解为物种鉴定和育种计划提供了实用工具，为研究苦木药用特性的遗传基础奠定了基础。本研究不仅推进了我们对叶绿体基因组进化的理解，也有助于开发这种珍贵药用植物的更好的治疗应用。

本文来自：物种分类及进化研究-公众号