西综笔记-生物化学-常用的分子生物学技术

一、PCR 技术（聚合酶链反应）

基本组成与特异性

反应体系：模板 DNA、特异 DNA 引物、耐热 DNA 聚合酶（如 Taq 酶）、dNTP、含 Mg²⁺缓冲液。

特异性来源：依赖特异 DNA 引物（非 RNA 引物），引物设计是 PCR 关键。

主要应用

目的基因克隆：体外大量扩增目标 DNA 片段。

基因表达检测：RT-PCR 检测 RNA（逆转录后扩增），实时定量 PCR 可定量分析。

DNA 序列分析：结合测序技术简化流程。

基因突变分析：检测突变、重排等，如单链构象多态性分析。

基因体外突变：通过引物设计实现点突变、缺失、嵌合等改造。

二、蛋白质 - 蛋白质相互作用研究技术

常用方法

酵母双杂交系统：经典方法，用于筛选细胞内相互作用的蛋白质。

免疫共沉淀（Co-IP）：通过抗体 - 抗原结合捕获互作蛋白。

GST Pull-down：利用谷胱甘肽标签蛋白钓取互作蛋白。

荧光能量共振转移（FRET）：检测分子间距离变化反映相互作用。

噬菌体展示技术：通过噬菌体表面展示筛选互作蛋白。

排除干扰技术

[视频]

蛋白质印迹（Western blotting）：用于检测蛋白质表达量，非相互作用。

基因剔除技术：研究基因功能，与蛋白质互作无关。

三、DNA - 蛋白质相互作用研究技术

常用技术

电泳迁移率变动测定（EMSA / 凝胶迁移分析）

原理：标记 DNA 探针与蛋白质结合后，电泳迁移率改变。

用途：体外检测 DNA 与蛋白质的结合。

染色质免疫沉淀法（ChIP）

原理：体内交联后，通过抗体富集 DNA - 蛋白质复合物并测序。

用途：研究体内特定蛋白质与基因组 DNA 的结合位点（如启动子区域）。

排除干扰技术

酵母双杂交：用于蛋白质 - 蛋白质互作，非 DNA - 蛋白质。

酶联免疫吸附测定（ELISA）：基于抗原 - 抗体反应，与核酸无关。

四、基因表达检测技术

1. RNA 检测

Northern blotting（RNA 印迹）：检测特定 RNA（mRNA、非编码 RNA）的表达水平。

RT-PCR（逆转录 PCR）：先将 mRNA 逆转录为 cDNA，再 PCR 扩增，用于 RNA 定量。

2. 蛋白质检测

Western blotting（蛋白质印迹）：检测蛋白质表达量，可半定量分析。

五、印迹技术总结

[视频]技术名称

检测分子

用途

Southern blotting

DNA

DNA 定性 / 定量分析

Northern blotting

RNA

RNA 表达水平检测

Western blotting

蛋白质

蛋白质表达量及互作研究

记忆口诀

南 D 北 R 西蛋白：Southern（DNA）、Northern（RNA）、Western（蛋白质）。

六、其他重要技术

1. 基因启动子结构分析

技术组合：PCR 结合测序（获取启动子序列）、核酸 - 蛋白质互作技术（EMSA、ChIP，研究转录因子结合）、生物信息学预测（如启动子数据库分析）。

2. DNA 测序技术

Sanger 双脱氧法（链末端合成终止法）：经典 DNA 测序方法，基于 ddNTP 终止链延伸。

七、易混点对比