北京大学-山东大学《Science》文章详解：如何发现神经酰胺的膜受体FPR2及其分子机制

2025年3月14日，北京大学基础医学院与山东大学孙金鹏教授团队联合北京大学医学部姜长涛、孔炜教授团队以及山东大学于晓教授团队，在《Science》期刊以加速评审形式在线发表题为"Metabolic signaling of ceramides through the FPR2 receptor inhibits adipocyte thermogenesis"的重要研究成果。该研究首次在脂肪细胞中鉴定出神经酰胺膜受体FPR2，系统解析了神经酰胺-FPR2信号轴调控脂肪组织产热的作用网络，并揭示了FPR2特异性识别神经酰胺的分子机制。这一发现不仅拓展了神经酰胺生物学功能的认知边界，更为代谢性疾病精准治疗策略的开发提供了新靶点。

神经酰胺作为鞘脂代谢的核心分子，其研究始于1884年德国化学家Thudichum对脑组织鞘脂（sphingolipids）的首次分离。该分子由鞘氨醇骨架和脂肪酸链构成二维结构多样性：脂肪酸链差异体现在碳链长度（C14-C26）及双键数目（0-3个）；鞘氨醇链则包含二氢鞘氨醇（DS）、植物鞘氨醇（P）等8种亚型。通过磷酸化、糖基化等翻译后修饰，哺乳动物体内已鉴定出约300种神经酰胺异构体。大量临床证据表明，循环神经酰胺水平异常升高与肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等代谢综合征显著相关。值得注意的是，神经酰胺可在数分钟内快速调控葡萄糖转运等生理过程，提示其可能通过膜受体介导非基因组效应。

研究揭示神经酰胺分子具备独特的双功能激活特性：其鞘氨醇骨架可代谢生成鞘氨醇-1-磷酸（S1P），通过激活S1PR1-5受体家族调控免疫细胞迁移等过程，相关靶向治疗药物已在多发性硬化症等疾病中取得临床突破（孙金鹏团队与艾丁、朱毅团队合作发现17,18-EEQ/S1PR1-Gq信号轴调控动脉粥样硬化进展，Nat Metab 2024）；而脂肪酸链的结构特征（碳链长度、双键位置及顺反构型）则决定其与特定GPCR的相互作用，如孙金鹏与于晓团队揭示的GPR120受体对单/双不饱和脂肪酸的特异性识别机制（Science 2023）。值得注意的是，神经酰胺可显著抑制细胞内cAMP水平（Gi/o蛋白激活的典型特征），这引发出关键科学问题：是否存在未被发现的GPCR亚型能够直接识别完整神经酰胺分子，并通过动态调控第二信使平衡介导核心细胞反应？这篇文章讲述了如何发现感受神经酰胺的受体与调控机制。

实验设计

1.模型与分组

（1）动物模型

• 野生型（WT）小鼠、脂肪特异性（Adipoq-Cre）或产热特异性（Ucp1-Cre）Fpr2敲除小鼠。
• 高脂饮食（HFD）或正常饮食（NCD）喂养小鼠，辅以腹腔注射C16:0神经酰胺（10 mg/kg）或对照溶剂。
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（2）细胞模型

• HEK293细胞过表达FPR2及其突变体，用于信号通路分析。
• 原代脂肪细胞（棕色和米色脂肪细胞）用于体外功能验证。

2.关键干预

• 神经酰胺处理：小鼠腹腔注射C16:0神经酰胺，观察冷暴露或HFD诱导的代谢表型（能量消耗、产热基因表达）。
• 基因敲除：通过CRISPR/Cas9技术生成Fpr2缺陷小鼠，验证受体依赖性效应。
• 药理学阻断：使用FPR2拮抗剂WRW4验证受体功能。

实验方法

1. 分子与细胞生物学技术

（1）受体筛选

• 基于GSE40486数据库筛选BAT高表达的GPCR，通过GloSensor-cAMP检测C16:0神经酰胺对FPR2的激活。
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（2）信号通路分析

• BRET技术检测Gαi蛋白解离和β-arrestin募集，验证FPR2的G蛋白偶联特性。
• 竞争性结合实验（125I标记Ac2-26）测定神经酰胺与FPR2的亲和力。

（3）基因表达分析

• qRT-PCR和Western blot检测产热基因（如UCP1）的表达变化。
• 免疫荧光和免疫组化定位FPR2在脂肪组织中的表达。

2. 结构生物学技术

• 冷冻电镜（cryo-EM）：解析FPR2与Gi蛋白及三种神经酰胺（C16:0、C18:0、C20:0）复合物的三维结构（分辨率3.2-3.6 Å）。
• 分子动力学模拟（MD）：模拟神经酰胺结合后FPR2的构象变化，验证疏水口袋的灵活性和特异性识别机制。

3. 代谢与生理学分析

• 代谢笼实验：监测小鼠氧气消耗（VO2）、能量消耗和运动活性，评估冷暴露或HFD下的产热能力。
• 温度测量：红外热成像检测BAT和皮下脂肪的局部温度变化。
• 葡萄糖与胰岛素耐受测试：GTT和ITT评估代谢功能。

4. 脂质组学与生化检测

• 神经酰胺定量：质谱分析血浆和脂肪组织中C16:0神经酰胺水平。
• 脂解活性检测：游离脂肪酸释放实验评估脂肪细胞脂解功能。

关键方法亮点

• 多组学整合：结合转录组（GSE40486）、脂质组和结构生物学数据，系统解析神经酰胺-FPR2轴的功能。
• 冷冻电镜技术：首次揭示FPR2与神经酰胺的精确结合模式，明确疏水口袋的构象可塑性。
• 基因编辑模型：通过脂肪或产热细胞特异性敲除小鼠，验证FPR2在组织特异性代谢调控中的作用。
• 动态信号监测：BRET和FIAsH-BRET技术实时追踪FPR2的构象变化及下游信号传导。

结果

1. (d18:1/C16:0)神经酰胺对产热的负向调控作用

对正常饮食（NCD）喂养的野生型（WT）小鼠连续3天进行腹腔注射（溶剂对照，C16:0神经酰胺），并在常温或低温条件下评估一系列产热指标。外源性C16:0神经酰胺处理显著降低了冷暴露期间小鼠的氧气消耗和能量代谢，但对摄食量和运动活性无显著影响。此外，C16:0神经酰胺还降低了冷暴露条件下小鼠的直肠温度及体表温度，抑制了冷诱导的棕色脂肪组织（BAT）活性和米色脂肪生成，并阻断了佛司可林诱导的原代脂肪细胞产热基因表达、脂解活性和能量消耗。为进一步探究C16:0神经酰胺对饮食诱导的适应性产热及肥胖的作用，采用高脂饮食（HFD）喂养WT小鼠并给予溶剂或C16:0神经酰胺处理，随后评估产热及肥胖相关表型。持续两周的外源性C16:0神经酰胺给药显著提高了HFD小鼠血浆、皮下白色脂肪组织（scWAT）和BAT中C16:0神经酰胺的水平。该处理还导致HFD小鼠的葡萄糖耐受性受损、胰岛素敏感性下降、氧气消耗减少及能量代谢降低。延长至8周的C16:0神经酰胺干预进一步加重了HFD小鼠的体重、肝脏重量、脂肪组织重量及甘油三酯水平的增加。

图1. BAT中神经酰胺膜受体的鉴定

(A) C16:0神经酰胺感应型GPCR筛选策略示意图。观察到C16:0神经酰胺处理BAT后快速诱导cAMP水平下降，随后基于表达水平筛选前60个候选GPCR，并通过GloSensor-cAMP检测其对C16:0神经酰胺的响应。(B) NCD喂养的WT小鼠经不同处理后产热测试流程示意图。小鼠腹腔注射C16:0神经酰胺（10 mg/kg/天）或对照溶剂3天，随后在25℃和4℃条件下进行产热指标检测。(C) 间接量热法测定NCD喂养WT小鼠在25℃（浅色区域）和4℃（深色区域）下的氧气消耗量（VO2，升/公斤/小时）。红色虚线框表示温度从25℃过渡至4℃需2.5小时（每组n=6）。(D) 0.5或1.5 μM C16:0神经酰胺刺激对WT小鼠BAT（左）和scWAT（右）cAMP水平的影响（n=6）。*P<0.05，P<0.01（与溶剂对照组相比）；数据采用双侧单因素方差分析（Tukey检验）。(E) C16:0神经酰胺对转染不同GPCR的HEK293细胞中福司柯林诱导的cAMP积累的抑制作用热图（GPR120及其激动剂9-HSA作为Gi偶联受体阳性对照）。数据为三次独立实验均值（n=3）。(F) C16:0神经酰胺诱导hFPR2或mFPR2过表达细胞中Gαi2-Gβγ解离的浓度效应曲线（n=3）。(G)** C16:0神经酰胺诱导原代脂肪细胞中Gαi2-Gβγ解离的浓度效应曲线（n=3）。

2. FPR2作为神经酰胺膜受体的鉴定

通过检测BAT、scWAT及成熟脂肪细胞中cAMP水平对C16:0神经酰胺刺激的响应发现：与正常饮食（0.5 μM）及高脂饮食（1.5 μM）血浆浓度相当的C16:0神经酰胺均可在15分钟内快速降低cAMP水平，提示Gi蛋白偶联受体可能介导了神经酰胺对脂肪组织的急性效应。基于GSE40486数据筛选出BAT中表达量最高的60种GPCR，并通过GloSensor-cAMP检测法发现：C16:0神经酰胺可剂量依赖性地抑制过表达FPR2的人胚胎肾细胞（HEK293）中佛司可林诱导的cAMP升高，其半数最大效应浓度（EC50）为3.3 ± 0.7 μM。进一步的Gαi1和Gαi2解离实验显示，C16:0神经酰胺激活人源FPR2（hFPR2）的EC50分别为350.6 ± 18.7 nM和357.1 ± 28.4 nM。尽管小鼠FPR2（mFPR2）与人源FPR2的序列同源性达85.5%，差异残基主要分布于胞内环1（ICL1）和胞外环3（ECL3），但C16:0神经酰胺激活mFPR2的Gαi2信号通路（EC50为1.25 ± 0.15 μM），而非Gαi1。上述EC50值与人和小鼠血浆中C16:0神经酰胺的生理浓度范围（0.4–1.6 μM）高度吻合。除G蛋白信号外，β-arrestin信号通路在脂肪细胞发育及代谢调控中亦发挥重要作用。尽管文献报道FPR2可通过β-arrestin信号介导中性粒细胞趋化（33,34），但该研究发现C16:0神经酰胺对过表达FPR2的HEK293细胞未引发β-arrestin募集或Gαq/Gα12激活。通过比较C16:0神经酰胺与其他内源性FPR2配体（如fMLFII、Ac2-26、LL-37和humanin）的效能发现C16:0神经酰胺在Gi信号激活中的效力与已知配体相当，但其效能显著降低，提示C16:0神经酰胺可能是FPR2的部分激动剂。为解析内源性FPR2在脂肪细胞中的功能，构建了编码G蛋白及β-arrestin1生物发光共振能量转移（BRET）探针的慢病毒系统，并利用脂肪细胞特异性Fpr2条件敲除（Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl）小鼠作为阴性对照。实验证实从Fpr2^fl/fl小鼠分离的原代脂肪细胞中，C16:0神经酰胺、LL-37和fMLFII可浓度依赖性地激活Gi信号，而Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl小鼠来源的脂肪细胞则完全丧失响应。值得注意的是，C16:0神经酰胺仅特异性激活Gi信号，而Gq及β-arrestin1信号未被检测到。原代脂肪细胞中Gi信号激活的EC50值为2.7 ± 0.7 μM，较过表达FPR2的HEK293细胞高约两倍。

图2. C16:0神经酰胺与脂肪细胞中FPR2的直接互作

(A) Fpr2fl/fl或Sox2-CreER+/-Fpr2fl/fl小鼠scWAT中FPR2（红色）与脂联素（白色）的免疫荧光染色。放大图显示scWAT脂肪细胞膜表面FPR2表达（每组n=3）。标尺：低倍50 μm，高倍10 μm。(B) scWAT脂肪细胞中FPR2免疫荧光强度定量分析（n=3）。(C) 放射性配体结合实验示意图（左）。C16:0神经酰胺对WT小鼠BAT（中）和scWAT（右）膜组分中125I-Ac2-26结合的竞争性抑制曲线（n=6）。(D) FIAsH-BRET实验设计示意图。Rluc标记于FPR2的N端，FIAsH基序（CCPGCC）插入ECL区。(E) FPR2 FIAsH-BRET传感器对C16:0神经酰胺（左）或fMLFII（右）刺激的最大响应（n=3）。NR：无响应。

3. FPR2与神经酰胺在脂肪细胞中的直接互作

GSE7032数据显示，分化成熟的原代棕色脂肪细胞中Fpr2表达显著上调。通过免疫组化分析发现FPR2蛋白主要分布于WT小鼠scWAT和BAT中表达脂联素的脂肪细胞膜上，而Fpr2缺陷（Sox2-CreER^+/−Fpr2^fl/fl）小鼠中则无此表达。为验证C16:0神经酰胺与FPR2的直接结合采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的高亲和力肽类激动剂WK(FITC)YMVm进行竞争性结合实验。构建Nanoluc（Nluc）标记的hFPR2质粒转染HEK293细胞后，WK(FITC)YMVm显示出特异性饱和结合曲线（Kd=3.2 ± 0.6 nM）。递增浓度的C16:0神经酰胺可剂量依赖性地抑制WK(FITC)YMVm与Nluc-FPR2间的BRET信号，其抑制常数（Ki）为323.6 ± 78.4 μM，与C16:0神经酰胺通过FPR2激活Gi活性的EC50值相当。进一步通过125I标记的FPR2肽类激动剂125I-Ac2-26进行体内结合实验，饱和结合分析显示：125I-Ac2-26与WT小鼠BAT、scWAT膜组分及hFPR2过表达HEK293细胞膜组分的Kd值分别为18.3 ± 1.8 nM、9.5 ± 0.4 nM和6.7 ± 0.4 nM。竞争性结合实验证实，C16:0神经酰胺可与125I-Ac2-26竞争结合上述膜组分，其Ki值分别为600.5 ± 38.9 nM、190.7 ± 25.7 nM和114.5 ± 13.3 nM。此外，Fpr2缺陷小鼠BAT和scWAT膜组分即使在高浓度未标记Ac2-26或C16:0神经酰胺存在下，仍无法与125I-Ac2-26结合。综合上述数据，确证了C16:0神经酰胺在体内直接与FPR2相互作用。

图3. C16:0神经酰胺通过FPR2抑制冷暴露诱导的产热

(A) NCD喂养的Adipoq-Cre^+/-Fpr2^fl/fl和Fpr2^fl/fl小鼠产热实验流程示意图。灰色：溶剂对照组；红色：C16:0神经酰胺处理组；蓝色：Adipoq-Cre^+/-Fpr2^fl/fl溶剂对照组；橙色：Adipoq-Cre^+/-Fpr2^fl/fl神经酰胺处理组。(B) 间接量热法测定小鼠在25℃和4℃下的能量消耗（千卡/公斤/小时）（每组n=7）。(C) 各组小鼠在25℃（光周期）和4℃（暗周期）下的平均能量消耗（n=7）。(D) 冷诱导产热实验设计示意图。(E) 急性冷暴露（3小时）后小鼠肩胛区和腹股沟区表面温度的红外成像（左）及定量（右）（每组n=5-7）。(F) 72小时冷暴露期间小鼠直肠温度变化（n=7）。(G) 冷暴露24小时后BAT组织的H&E染色（上）和UCP1免疫组化（下）（标尺=30 μm）。

4. 神经酰胺结合诱导的FPR2构象变化

GPCR配体结合通常引发胞外结构域特异性构象变化。为解析FPR2的构象动力学构建了FlAsH-BRET传感器监测神经酰胺结合对FPR2胞外环（ECL）构象的影响，并与另一内源性激动剂fMLFII进行对比。实验表明C16:0神经酰胺结合导致FPR2的N端向ECL1和ECL2区域靠近，而fMLFII结合则使N端远离ECL2。这一差异提示C16:0神经酰胺通过诱导FPR2胞外域特异性构象变化，可能影响其信号转导特异性。

5. C16:0神经酰胺通过激活FPR2抑制基础或冷诱导的产热效应

为探究C16:0神经酰胺对冷诱导产热的抑制作用是否依赖脂肪细胞中FPR2的表达，该研究构建了脂肪特异性（Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl）和产热特异性（Ucp1-Cre^+/−Fpr2^fl/fl）基因敲除小鼠模型。将Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl、Ucp1-Cre^+/−Fpr2^fl/fl及其同窝对照Fpr2^fl/fl小鼠置于正常饮食（NCD）条件下，连续3天腹腔注射C16:0神经酰胺（10 mg/kg/天）或对照溶剂，随后通过代谢笼系统监测其在25°C（24小时）及4°C（24小时）环境中的摄食量、活动量、氧耗量与能量消耗。结果显示无论是否接受C16:0神经酰胺处理，Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl、Ucp1-Cre^+/−Fpr2^fl/fl与Fpr2^fl/fl小鼠的摄食量与运动活性均无显著差异。外源性C16:0神经酰胺显著抑制Fpr2^fl/fl小鼠在常温或低温环境下的能量消耗与氧耗量，而这一效应在Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl或Ucp1-Cre^+/−Fpr2^fl/fl小鼠中完全消失。进一步评估C16:0神经酰胺在冷暴露后对脂肪细胞产热的FPR2依赖性效应，研究者对NCD喂养的Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl、Ucp1-Cre^+/−Fpr2^fl/fl及同窝对照Fpr2^fl/fl小鼠腹腔注射C16:0神经酰胺（10 mg/kg/天）或溶剂对照。冷暴露（4°C）3小时后，通过红外热成像检测棕色脂肪组织（BAT）与皮下白色脂肪组织（scWAT）的局部温度，并在72小时内连续记录直肠温度。结果显示，C16:0神经酰胺处理显著降低对照小鼠的直肠温度及腹股沟区、肩胛间区的局部温度，同时抑制UCP1蛋白水平及产热相关基因表达。H&E染色与免疫组化进一步证实，C16:0神经酰胺处理抑制Fpr2^fl/fl小鼠的BAT活性与米色脂肪生成。然而，上述效应在Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl或Ucp1-Cre^+/−Fpr2^fl/fl小鼠中完全消除。值得注意的是，白色脂肪组织中Fpr2的缺失可独立于外源性C16:0神经酰胺负荷，通过上调UCP-1等产热相关基因表达促进产热。生理状态下，内源性神经酰胺可能通过FPR2抑制白色脂肪向棕色脂肪转化及产热过程。采用FPR2多肽拮抗剂WRW4的实验结果同样显示UCP1水平与产热能力降低。综上，C16:0神经酰胺通过激活脂肪细胞中的FPR2受体抑制生理性冷刺激诱导的产热效应。

图4. hFPR2-Gi复合物与神经酰胺结合的整体结构

(A) 神经酰胺结构示意图：鞘氨醇碱基通过酰胺键与不同链长的脂肪酸连接。(B) 不同神经酰胺或亚结构诱导hFPR2过表达细胞中Gαi2-Gβγ解离的效力热图（EC50值）。NR：无响应（n=3）。(C) C16:0（橙色）、C18:0（品红）、C20:0（亮粉）神经酰胺结合FPR2-Gi复合物的冷冻电镜密度图（分辨率3.2-3.6 Å）。(D) 配体结合口袋切割视图：C16:0神经酰胺（FPR2-Gi，PDB: 8Y62）、C18:0（PDB: 9JHJ）、C20:0（PDB: 8Y63）及C16:0-CYSLTR2-Gq（PDB: 9JH5）复合物中配体垂直嵌入深度比较。鞘氨醇链与FPR2芳香残基F1103.37和F2576.51直接互作。

6. C16:0神经酰胺通过FPR2抑制饮食诱导的适应性产热

为评估C16:0神经酰胺对饮食诱导适应性产热的抑制作用是否依赖FPR2激活，对高脂饮食（HFD）喂养的Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl及同窝对照Fpr2^fl/fl小鼠隔日腹腔注射C16:0神经酰胺（10 mg/kg）或溶剂对照，持续2周以排除肥胖代谢干扰。随后进行葡萄糖耐量试验（GTT）、胰岛素耐量试验（ITT）及代谢笼监测（25°C，24小时）。结果显示，C16:0神经酰胺处理显著损害对照小鼠的糖耐量、胰岛素敏感性及产热能力，而在Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl小鼠中无此效应。进一步探究C16:0神经酰胺在肥胖模型中的作用是否依赖FPR2，研究者对HFD喂养的Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl及对照小鼠隔日注射C16:0神经酰胺（10 mg/kg）或溶剂，持续8周。结果显示，C16:0神经酰胺处理的Fpr2^fl/fl小鼠表现出更高的体重、肝脏重量、scWAT重量、附睾白色脂肪（eWAT）重量、BAT重量及甘油三酯水平，而Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl小鼠在HFD条件下无此表型。

7. FPR2对神经酰胺的识别特异性及其复合物整体结构

神经酰胺的生理功能受脂肪酰基链长度及特定位置双键（C=C）的调控。通过系统评估不同脂质结构对FPR2的激活能力，发现仅饱和脂肪酰基链的神经酰胺（C2:0、C6:0、C10:0、C16:0、C18:0、C20:0）可激活FPR2下游Gi信号，而含不饱和双键（C18:1、C24:1）或超长链神经酰胺无此活性。为解析FPR2特异性识别长链神经酰胺的结构基础，研究者利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析了人源FPR2与Gi1及三种神经酰胺（C16:0、C18:0、C20:0）的复合物结构。通过筛选总计2,581,129（C16:0）、4,262,248（C18:0）及2,024,422（C20:0）个单颗粒，分别获得整体分辨率为3.2 Å的复合物结构（受体区域分辨率分别为3.7 Å、3.8 Å及3.6 Å）。通过局部优化受体掩膜，C16:0及C20:0神经酰胺-FPR2复合物的受体区域分辨率分别提升至3.5 Å及3.4 Å，而C18:0复合物未见显著改善。结构显示，神经酰胺以“p”形折叠垂直插入FPR2的正构结合位点，与天然激动剂fMLFII及humanin的结合模式相似。该结合模式显著区别于Gq偶联的神经酰胺受体CYSLTR2（后者通过TM4-TM5间的倾斜开口结合配体）。FPR2配体口袋由跨膜区TM3、TM5-TM6及胞外环ECL1、ECL2共同构成，呈现深而广的特征。C16:0、C18:0及C20:0神经酰胺在FPR2口袋内的垂直嵌入深度分别为22.5 Å、23.4 Å及24 Å，显著长于fMLFII（约15.6 Å），与humanin（约26 Å）相当。

8. 神经酰胺在FPR2正构位点的结合模式

在C16:0、C18:0及C20:0神经酰胺-FPR2-Gi1复合物结构中，神经酰胺由C18鞘氨醇链与N-酰基链通过中心酰胺键连接。鞘氨醇链的脂肪酰基深入配体口袋，占据fMLFII的结合位置，并通过芳香残基F110³·³⁷与F257⁶·⁵¹直接作用于激活传感器W254⁶·⁴⁸。该链嵌入由L109³·³⁶、F110³·³⁷、R201⁵·³⁸、R205⁵·⁴²及F257⁶·⁵¹构成的疏水口袋（图5A-D及附图S23B-D）。突变L109³·³⁶A、F110³·³⁷A、R201⁵·³⁸A、R205⁵·⁴²A或F257⁶·⁵¹A显著削弱神经酰胺诱导的FPR2激活（图5F；附图S24A-C、H-I；S25A-C；表S6）。H102³·²⁹与F178ECL2通过长程π-π堆积与神经酰胺的不饱和双键相互作用（图5A-D及附图S23B-D），其突变（H102³·²⁹L/A或F178ECL2L/A）显著降低神经酰胺对FPR2的激活能力（图5F及附图S24D、J；S25A、D）。

图5. FPR2对神经酰胺的识别机制

(A-C) C16:0（A）、C18:0（B）、C20:0（C）神经酰胺与FPR2配体口袋残基的相互作用（红色虚线：氢键；紫色：极性作用；粉色：双键识别；绿色：疏水作用）。(D) 配体结合口袋残基互作模式条码图：橙色圆圈标示C18:0/C20:0特异性残基；浅蓝标示共有残基。(E) 分子动力学模拟中FPR2残基与C16:0（蓝）和C20:0（红）神经酰胺的接触频率。(F) FPR2关键突变体对C16:0或C20:0神经酰胺诱导Gαi2活性的影响（ΔpEC50=突变体pEC50-野生型pEC50）。绿色/蓝色背景标示偏向性残基（n=3）；P<0.05，P<0.01，P<0.001。

面向溶剂的脂肪酰基链（C16:0、C18:0、C20:0）呈现环状或S型折叠，与humanin的连续亮氨酸残基（L9-L12）空间重叠（附图S23E-F）。突变脂肪酰基周围疏水口袋中的残基（如L167ECL2、V169ECL2）可破坏FPR2对神经酰胺的响应，表明胞外区疏水环境对配体结合至关重要（图5F及附图S24E-F、K-L；S25A、E-F）。通过分子动力学（MD）模拟（附图S26A-C），发现E89ECL1、T177ECL2及D281⁷·³²与神经酰胺鞘氨醇基团的羧酸基团形成相互作用（图5E及附图S26D-F），而V284⁷·³⁶参与疏水接触（图5E及附图S26D-F）。上述残基的丙氨酸突变均削弱FPR2对C16:0或C20:0神经酰胺的激活（图5F及附图S24G、M；S25A、G）。

9. FPR2对神经酰胺识别特异性的调控机制

FPR2选择性识别长链神经酰胺（C14-C20），但对超长链（C22-C26）及不饱和神经酰胺（C18:1、C24:1等）无响应。尽管C-C单键与C=C双键的键长差异仅为0.02 Å，但C=C双键的平面刚性显著影响脂肪酸的几何构象及其下游功能。进一步发现，C16:0神经酰胺（p构象）、C18:0神经酰胺（s构象）和C20:0神经酰胺（s构象）的脂肪酸链在FPR2-Gi复合物中均呈现弯曲构型。脂肪酸链中C=C双键的存在会破坏这种特异性环状构象，导致其无法与FPR2的配体结合口袋兼容（图6C）。分子动力学（MD）模拟进一步支持这一结论：C18:1和C24:1神经酰胺（ω-9位含C=C双键）无法与FPR2形成稳定相互作用（图6D及图S26G）。另一重要发现是，饱和Cn:0神经酰胺的活性随脂肪酸链碳原子数增加而增强，但碳链长度达22原子时活性消失（图4A-B及图S18A-C）。例如，C20:0神经酰胺激活FPR2的效能约为C16:0的6倍（图4A-B及图S18B、E）。与此一致，低剂量C20:0神经酰胺（3 mg/kg）对冷诱导产热的抑制作用显著强于C16:0（图S18F-L）。在C16:0、C18:0和C20:0神经酰胺-FPR2-Gi复合物中，脂肪酸链的疏水部分被TM5、ECL2和ECL3的疏水残基包围，形成体积为2425.03 ų的配体口袋（图6A）。增加碳链长度可增强与FPR2的疏水接触（图S23G-I）。例如，C20:0结合诱导N179ECL2和L272ECL3向内位移，并与V167ECL2、Y175ECL2及N179ECL2形成额外接触（图6B及图S23J）；C18:0则与I169ECL2和N179ECL2产生特异性相互作用（图S23K）。这些残基的突变对C18:0和C20:0的激活效应影响更显著（图5F及图S24E-F、K-L，S25A、E-F）。上述结果表明，FPR2疏水口袋的可塑性是其适应不同链长神经酰胺的关键，但该口袋尺寸可能无法容纳超长链神经酰胺（图6E及图S26H）。

图6. FPR2选择性识别神经酰胺的结构基础

(A) 配体口袋分割视图：上部容纳脂肪酸链（红色虚线），下部容纳鞘氨醇链（绿色虚线）。(B) C20:0神经酰胺脂肪酸链与V167ECL2、Y175ECL2、N179ECL2的额外接触。(C) 脂肪酸链ω-9位双键破坏环状构象，与FPR2口袋不兼容。(D-E) 分子动力学模拟显示C18:1（D）和C24:0（E）神经酰胺在FPR2中的均方根偏差（RMSD）波动，提示结构不稳定性。

10. 神经酰胺对FPR2的选择性作用及其近缘受体的比较

为解析神经酰胺信号特异性，测试了C16:0对FPR2近缘GPCR（FPR3、FPR1、GPR32、C5R1、CMKLR1、GPR1）的激活能力，发现这些受体均无响应（图7A-B、S27A-C及表S9）。序列比对显示，FPR1和FPR3与FPR2同源性分别为78.9%和82.4%（图7C及S31）。FPR2中参与识别鞘氨醇羧酸基团（如E89ECL1、D2817.32）及C=C双键（如H1023.29）的关键残基在FPR1中被替换为G或F（图7C-D）。突变实验证实，E89ECL1G、D2817.32G和H1023.29F显著削弱FPR2对神经酰胺的响应（图7F及S27D-G，表S10）。FPR3中L1985.35、R2015.38和R2055.42分别突变为A、F和H，其对应突变亦降低FPR2活性（图7C、E-F及S27D-G）。此外，其他近缘受体缺乏“E ECL1 & H3.29”基序，而将该基序引入FPR1（G89ECL1E）和FPR3（A1985.35L-H2055.42R）可赋予其神经酰胺响应能力（图7G-J、S27H-J及表S11）。这些结果确立了E89ECL1、L1985.35和R2055.42为神经酰胺识别的关键决定因素。

图7. FPR2特异性识别C16:0神经酰胺的进化保守性

(A) FPR2与系统发育相关受体的聚类树。(B) HEK293细胞过表达不同受体对C16:0神经酰胺的cAMP抑制效力（EC50）与最大响应（Emax）热图（n=3）。(C) hFPR2、mFPR2及相关受体关键识别残基序列比对。(D-E) FPR1（粉）-FPR2（绿）（D）及FPR3（棕）-FPR2（绿）（E）与C16:0神经酰胺（紫）的结构比较。(F) FPR2配体口袋突变对C16:0神经酰胺活性的影响（ΔpEC50与Emax热图）。(G-H) FPR1（G89ECL1E）和FPR3（A1985.35L-H2055.42R）突变赋予受体神经酰胺响应活性（n=3）。(I-J) 突变体FPR1（I）和FPR3（J）对C16:0神经酰胺的浓度效应曲线（***P<0.001，###P<0.001）。

11. 神经酰胺激活FPR2的潜在分子机制

基于AlphaFold预测的apo-FPR2模型（图8A-B），通过对比冷冻电镜结构与分子动力学模拟，揭示了神经酰胺结合诱导的构象变化（图8C-G及表S18）。C16:0神经酰胺的鞘氨醇链与F1103.37和F2576.51直接作用，触发侧链旋转及F2576.51下移，进而通过π-π堆积拉动“触发开关”W2546.48（图8D）。这一构象变化传递至保守的V3.40P5.50F6.44基序（图8E），并引发胞内区D3.49R3.50(Y/C)3.51和N7.49P7.50XXY7.53基序的重排：D1223.49-R1233.50盐桥断裂，R1233.50侧链延伸至TM7，与Y642.43、Y2215.58及Gαi的C351羰基形成极性网络（图8F）；TM7外移导致N2987.49、P2997.50和Y3027.53重新排布，Y3027.53与Y2215.58形成π-π堆积，并与R1233.50产生π-阳离子相互作用（图8G）。

图8. C16:0神经酰胺激活FPR2的分子机制

(A) 冷冻电镜解析的C16:0-FPR2-Gi（蓝）与AlphaFold预测的apo-FPR2（灰）结构对比。(B) apo-FPR2在400 ns分子动力学模拟中的RMSD波动。(C) C16:0神经酰胺结合诱导TM6胞质端外移（蓝：结合态；灰：apo态）。(D-G) 结构比较显示：神经酰胺结合导致F1103.37/F2576.51/W2546.48 π-π堆积（D）、V3.40P5.50F6.44基序（E）、D3.49R3.50Y3.51基序（F）及N7.49P7.50xxY7.53基序（G）构象重排，激活Gαi信号。

讨论

神经酰胺通过抑制脂肪产热促进肥胖相关胰岛素抵抗及肝脂肪变性，但其细胞机制尚不明确。该研究发现，FPR2通过偶联Gi蛋白介导C16:0神经酰胺对BAT和皮下脂肪cAMP信号的抑制，进而抑制产热。脂肪特异性敲除Fpr2可逆转上述效应，且FPR2对神经酰胺的亲和力（0.4-1.6 μM）与其生理浓度匹配，提示其在代谢调控中的核心作用。靶向FPR2或为治疗神经酰胺相关代谢紊乱提供新策略。

与S1PR1、GPR120等脂质受体相比，FPR2配体口袋兼具共性与特性：其疏水区可容纳长链脂肪酸，极性基序则参与鞘氨醇识别。FPR2口袋体积（2425.0 ų）显著大于同类受体（如S1PR1：722.3 ų），且通过柔性区域适应不同链长神经酰胺。值得注意的是，FPR1和FPR3因关键残基缺失无法响应神经酰胺，而GSE40486数据表明二者在脂肪组织中低表达，进一步支持其不参与产热调控。

该研究首次确立了FPR2作为神经酰胺受体的身份，并通过结构-功能分析阐明其特异性机制。尽管目前聚焦于C16:0及脂肪组织，作者近期发现CYSLTR2和P2RY6等Gq偶联神经酰胺受体参与动脉粥样硬化，提示存在多样化的神经酰胺信号网络。未来研究需拓展至其他神经酰胺亚型及组织类型，以全面解析其病理生理意义。

神经酰胺的定量方法

神经酰胺是鞘脂的一类，使用质谱可以进行精确的定量。

取棕色脂肪组织（BAT）和皮下白色脂肪组织（scWAT）各20 mg，加入200 μl水匀浆1分钟，通过BCA法测定蛋白浓度。随后加入800 μl含1.25 μM内标Ceramide（d18:1/19:0）的氯仿:甲醇（2:1）混合液，涡旋震荡后于4℃、13,000转/分钟离心10分钟，收集下层有机相并采用Termovap样品浓缩仪浓缩。

血浆样本（20 μl）与30 μl无菌水混合，加入200 μl含1.25 μM内标Ceramide（d18:1/19:0）的氯仿:甲醇（2:1）溶液，涡旋震荡后于4℃、13,000转/分钟离心10分钟，收集下层有机相浓缩。沉淀物溶解于100 μl异丙醇:乙腈（体积比1:1）混合液，采用Waters XBridge Peptide BEH C18色谱柱（3.5 μm，2.1×100 mm；美国Waters公司），联用液相色谱系统与质谱仪进行分析。

参考文献

Lin H, Ma C, Cai K, Guo L, Wang X, Lv L, Zhang C, Lin J, Zhang D, Ye C, Wang T, Huang S, Han J, Zhang Z, Gao J, Zhang M, Pu Z, Li F, Guo Y, Zhou X, Qin C, Yi F, Yu X, Kong W, Jiang C, Sun JP. Metabolic signaling of ceramides through the FPR2 receptor inhibits adipocyte thermogenesis. Science. 2025 Mar 13:eado4188. doi: 10.1126/science.ado4188. Epub ahead of print. PMID: 40080544.

https://www.science.org/doi/10.1126/science.ado4188

https://sbms.bjmu.edu.cn/xyxw/3b2a49486476491b95b9f6d7f2bf8724.htm