手把手教会免疫共沉淀（CoIP）到底怎么做--实验技能篇
第一部分 背景知识介绍
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是常用的验证蛋白-蛋白互作的方法，本教程以293T细胞为例，带大家全流程走完CoIP流程，实际应用中，大家可以根据自己实验细胞进行调整。
在进行实验操作之前，我们给大家梳理一下，什么是免疫共沉淀？该技术如何实现对靶点互作蛋白的检测？该技术的主要优缺点有哪些？进行简单的介绍。
什么是免疫共沉淀？
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）技术是一种基于抗体与抗原特异性结合的经典实验方法，用于揭示细胞内蛋白质间的相互作用。该技术能够有效验证两种蛋白质在生理状态下是否存在相互作用。其基本原理在于，当细胞在非变性条件下裂解时，细胞内原本存在的多种蛋白质复合物得以保留。此时，若使用针对蛋白质X的抗体进行免疫沉淀，则与X在细胞内结合的蛋白质Y也会随之被沉淀下来。
常用的检测办法
目前，常用的方法是将精制的Protein A/G（有的两种都结合至磁珠）预先结合并固化在琼脂糖珠（agarose beads）上。当这些 beads 与含有抗原的溶液和抗体反应后，beads 上的 Protein A/G就能吸附抗原，从而达到纯化的目的。这种方法常用于检测两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于鉴定特定蛋白质的新作用伙伴。
CoIP的主要优缺点
###该方法的优点包括：
- 相互作用的蛋白质均经过翻译后修饰，保持了天然状态；
- 蛋白质间的相互作用在自然状态下进行，避免了人为干扰；
- 能够分离得到处于天然状态的蛋白质复合物。
### 该方法也存在一些局限性：
- 可能无法检测到低亲和力或瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用；
- 两种蛋白质的结合可能并非直接作用，而是通过第三者作为桥梁；
实验前需预测目的蛋白，并据此选择合适的抗体进行最终检测，若预测不准确，则实验可能无法获得预期结果，具有一定的风险性。
第二部分 免疫共沉淀 （CoiP）实践操作
1.细胞铺板
Day01，10cm或者15cm dish 铺板293T细胞，根据细胞体积大小，使得Day02 细胞融合度达到70%左右即可，这样在转染后细胞可以生长48-72h，融合度达到95%以上。
2.细胞转染
Day02，293T细胞完全贴壁后，开始进行转染外源性表达目的质粒，以10cm dish 为例，先前构建好的过表达TP53基因（TP53-flag）和RB基因（RB-GFP）：
（注：转染前，37°C预热完全培养基，换液。另外，切记同时进行一个空白对照，可用empty vector-GFP载体同时转染一个空白对照。）
3.转染后换液
一般转染后8h可进行换液。根据Lipo3000 Protocol，亦可直接过夜后再换液。换液前需37°C预热完全培养基。因293T细胞贴壁不牢，换液时注意贴着培养皿壁，缓慢吸液和加液。
4.评估转染情况
Day03 转染24h后，可以通过荧光显微镜观察转染情况。因RB基因带有GFP标签，可以看到转染成功表达RB基因的细胞可以发绿光。
5.48-72h收细胞进行CoIP
（1）一般根据实验，可在48-72h内收集细胞。收集细胞前，冰上配置裂解液：
（2）预冷1X PBS，对细胞进行清洗3遍，然后加入配置好的裂解液，冰上裂解30min，可以细胞刮刮下细胞，转移至1.5mL EP管中，放4°C冰箱摇床上裂解30min。可根据实验情况，辅助超声裂解：5-10 sec，15-30 cycle。（Tips：此过程应全程冰上操作。）
（3）在处理好细胞样品后，开始进行对珠子进行平衡：
可以用flag或者GFP的Agarose或者Magnetic-bead，根据自己实验室购买情况选用即可；吸取bead时，记得轻微混匀。
I．预冷1X TBS，取15-20μL bead至1.5mL EP管中，200μL 1X TBS ；如果用Agarose-bead，清洗完成后1000g 离心1min，吸净清洗液，留取bead。如果用magnetic-bead，则可用磁力架收集bead，然后吸净清洗液；清洗3遍。
（4）Bead 和蛋白共孵育：
I．待裂解时间完成后，收集总蛋白：
提前预冷离心机至4°C，14000g 离心10min；收集总蛋白上清至新的1.5mL EP管中分装：Input样品和CoIP样品。
（Input样品可以加入等体积2X loading buffer后，99°C 8-10分钟煮蛋白，然后保存待上样。）
II．CoIP
将剩余的总蛋白，加入至含有清洗完成的bead 的EP管中共孵育，根据实验情况，可以4°C摇床4h或者过夜。
III．孵育完成后，收集bead。对于Agarose-bead，预冷好的4°C离心机中，1000g 1min离心；对于Magnetic-bead，磁力架收集珠子；弃裂解液。
IV．清洗bead。预冷1X TBS 200-500μL 清洗bead，弃清洗液，共清洗3-5遍。
V．完成清洗后，加入60-100μL RIPA裂解液，加入等体积2X loading buffer后，99°C 8-10分钟煮蛋白。对于Agarose-bead可以煮好直接上样；对于Magnetic-bead，磁力架收集珠子；吸出液体至新的1.5mL EP管中。至此，用于CoIP的SDS-PAGE电泳的样品已全部制备完成，后续即可走常规Western-blog流程。
VI．注意：对于empty-vector-GFP样品同样操作流程。
6.SDS-PAGE电泳
根据蛋白大小，提前配置好胶，点样进行电泳。
7.转膜
电泳完成后，即可用转膜，一般用PVDF膜，根据蛋白大小，设置转膜时间和电流或者电压。
8.抗体孵育及显影
转膜完成后，5%脱脂牛奶室温孵育1-2h，然后孵育一抗，洗膜，孵育二抗，曝光。
9.最终结果分析(示例)
（Tips:结果解读（本例为示例，不代表真实实验情况））
I.先看Input：在单转染empty-vector的input（1）结果中，通过直接孵育TP53一抗和GAPDH一抗，正常曝光出TP53（3）和GAPDH（5），而孵育GFP一抗的RB没有曝光出来；但是在共转TP53-flag和RB-GFP的Input（2）结果中，孵育TP53一抗、GFP一抗和GAPDH一抗，均能正常曝光出三个目的蛋白，而且在（2）中的TP53表达量明显高于（1）中，说明TP53和RB蛋白的外源表达正常。如果孵育TP53-flag的flag一抗能够曝光出来TP53，则更能说明外源表达正常。
II．再看IP结果：由于通过Agarose-bead或者Magnetic-bead纯化了目的蛋白，此示例通过GFP纯化RB-GFP，理论上仅收集得到的与bead结合RB蛋白，同时因为TP53与RB蛋白有互作，因此此时也把TP53蛋白拉下来。所以，在曝光目的TP53和RB蛋白时，均能正常显影。而因为GAPDH没有与RB蛋白有互作，因此，孵育GAPDH一抗后，完成二抗孵育后曝光，则没有显影。
（爱自己！！！做科研!!! 每文格"作家张涔汐说，我们应该学会的不仅仅是远离垃圾人，更要把冲突和矛盾扼杀在摇篮里。"如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论，攻击性人格请请请不要关注和阅读！！！）
