双剑合璧：人参与丹参打造免疫防线，抑制癌细胞扩散
肿瘤转移已成为癌症治疗中的一大挑战，而中医药凭借其多成分、多靶点的特点，为抗肿瘤转移提供了全新思路。2024年10月由陆茵（南京中医药大学药学院）、魏中鸿（南京中医药大学药学院）、陶丽（扬州大学药学院）团队发表在《Journal of Advanced Research》（最新影响因子/JCR分区：11.4/Q1）题为“Synergistic potentiation of the anti-metastatic effect of a Ginseng-Salvia miltiorrhiza herbal pair and its biological ingredients via the suppression of CD62E-dependent neutrophil infiltration and NET formation”的文章聚焦于药对配伍——人参与丹参，揭示了它们如何通过调控中性粒细胞相关的肿瘤免疫微环境，显著抑制肿瘤转移。研究中发现，丹参中的隐丹参酮（CPT，cryptotanshinone）可下调内皮细胞中的 CD62E 表达，从而减少中性粒细胞的黏附和募集，而人参中的人参皂苷（ginsenoside）Rg1 则有效抑制了中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成。通过体内外多种实验手段，该研究为人参与丹参联合抗肿瘤转移提供了坚实的理论依据。
亮点
1) 协同抗转移效应：人参-丹参组合较单药显著抑制肿瘤转移，证实中药配伍的协同优势。
2) 中性粒细胞微环境参与：首次揭示该组合通过调控中性粒细胞相关机制（CD62E依赖性浸润和NETs形成）发挥抗转移作用。
3) 关键成分发现：
- 丹参活性成分CPT通过抑制内皮细胞CD62E表达，阻断中性粒细胞募集
- 人参活性成分Rg1通过抑制ROS/ERK-MAPK通路减少NETs形成，逆转NETs促转移效应
4) 创新研究模型：采用"效应-靶点-成分"反向药理学模型，结合多组学分析和功能验证，阐明复方物质基础。
背景补充
1) TIMER数据库
TIMER数据库（Tumor Immune Estimation Resource）是一个基于TCGA数据构建的在线分析平台，主要用于评估各种肿瘤中免疫细胞的浸润情况。研究者可以利用TIMER查询特定基因（例如CD62E、HIST3H3、ELANE、MPO等）的表达水平、拷贝数变化以及它们与免疫细胞浸润之间的相关性，从而探索基因表达和免疫微环境对肿瘤进展和预后的影响。在该研究中，TIMER数据库被用于分析CD62E表达与中性粒细胞浸润之间的正相关性，以及某些与NETs形成相关基因的变化与中性粒细胞浸润程度之间的关系，为揭示肿瘤微环境调控机制提供了有力的数据支持。TIMER数据库的核心功能：
- 免疫细胞浸润量化
- 基于RNA-seq数据，通过机器学习算法（如CIBERSORT、MCP-counter）估算肿瘤组织中 6种核心免疫细胞（B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞）的浸润水平。
- 支持泛癌分析，覆盖33种癌症类型。
- 临床预后关联分析
- 提供生存分析模块，可评估特定免疫细胞浸润程度与患者总生存期（OS）、无病生存期（DFS）的相关性。
- 基因-免疫互作网络
- 分析目标基因表达与免疫细胞浸润的相关性（如正/负调控关系）。
- 探索基因突变（如TP53、KRAS）对免疫微环境的影响。
2) LLC细胞
LLC（Lewis Lung Carcinoma）细胞系最初由 C.C. Litchfield 和 L.F. Dickie 于 1951 年从 C57BL/6 小鼠的自发性肺癌中分离并建立。由于其高侵袭性和易于在同源小鼠中成瘤的特性，该细胞系被广泛用于肺癌研究，特别是在肿瘤生长、转移及抗肿瘤药物评估等方面。主要有以下特点：
- 高侵袭性和转移性：LLC 细胞可在体外培养，并在 C57BL/6 小鼠体内形成高度侵袭性的原位肿瘤，且容易发生肺部及远端器官的转移。
- 快速增殖：该细胞系增殖速度快，适合用于短期实验和快速筛选抗癌药物。
- 对免疫治疗敏感：LLC 肿瘤模型常用于研究免疫治疗策略，如 PD-1/PD-L1 抑制剂、细胞因子治疗等。
- 适用于多种实验：LLC 细胞广泛用于体外细胞实验（如增殖、迁移、侵袭实验）以及体内小鼠模型（如皮下成瘤模型和肺转移模型）。
研究方法
1) 动物模型构建：
- 建立LLC细胞实验性肺转移模型（尾静脉注射）
- 分组干预：单药（人参/丹参提取物）vs. 组合，活性成分（Rg1/CPT）单用及联用
- 活体成像、Micro-CT监测转移，H&E染色评估病理改变
2) 多组学分析：
- 肺组织RNA测序筛选差异基因，GO/KEGG/GSEA富集分析关键通路
- TIMER数据库分析中性粒细胞浸润与临床预后的相关性
3) 机制解析技术：
- 中性粒细胞相关研究：
- 流式细胞术/MACS分离肺中性粒细胞
- 免疫荧光/WB检测NETs标志物（H3cit、MPO、NE）
- 流式ROS检测、Transwell侵袭实验、血管通透性检测（FITC-dextran）
- 分子机制验证：
- 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）模型研究CD62E调控
- 构建CD62E过表达细胞系，流室动态黏附实验验证CPT作用
- WB检测ERK/MAPK信号通路激活
4) 成分筛选体系：
- TNF-α刺激HUVECs模型筛选丹参成分（LA/RA/Tan系列化合物）
- PMA诱导NETs模型筛选人参皂苷成分（Rg1/Rg3等）
- 体外功能实验（细胞黏附、NETs形成、肿瘤细胞侵袭/EMT）
5) 协同效应验证：
- 活性成分联用（Rg1+CPT）体内外实验验证协同抗转移效果
- 多指标评估：中性粒细胞浸润、NETs水平、转移灶数量、血管渗漏等
摘要
背景：人参-丹参药对配伍乃治疗气滞血瘀型转移性肿瘤之效方，然其协同作用之分子机制尚未阐明。本研究通过解析中性粒细胞在肿瘤血行转移中的关键作用，揭示人参-丹参配伍的药效学基础，并采用"效应-靶点-成分"反向药理学研究模式，筛选潜在活性成分，确定主导组分配伍。
方法：构建实验性肺转移模型，比较人参、丹参单用及配伍的抗肿瘤效应；采用RNA测序技术锁定关键生物学事件与靶点，通过检测CD62E表达及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）释放筛选有效物质；结合体内外实验体系探究其作用机制与治疗意义。
结果：较之单药，人参-丹参配伍显著抑制肿瘤转移，并减少肺组织中性粒细胞浸润。丹参活性成分CPT通过下调内皮细胞E-选择素（CD62E）表达，抑制中性粒细胞黏附与肺组织募集；人参皂苷Rg1则能减轻NETs形成并逆转其促瘤效应。Rg1与CPT联用可协同抑制体内肿瘤转移。
结论：人参-丹参通过抑制中性粒细胞启动的转移级联反应早期（CD62E依赖性浸润）与晚期（NETs形成）阶段，实现抗转移效应的协同增效。Rg1与CPT分别为两味中药的协同活性成分。
前言
肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞对肿瘤发生、转移及免疫治疗应答具有关键调控作用。作为外周血与骨髓中最丰富的先天免疫细胞，中性粒细胞在癌症中扮演复杂而重要的角色，其浸润程度与多种癌症类型密切相关。通过促进血管生成、增强肿瘤细胞运动与侵袭能力，并介导"免疫抑制转换"影响其他免疫细胞，中性粒细胞成为肿瘤转移的重要推手。
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由DNA和颗粒蛋白（如瓜氨酸化组蛋白H3cit、中性粒细胞弹性蛋白酶NE、髓过氧化物酶MPO等）组成的网状结构，可响应佛波酯（PMA）等刺激物释放。最新研究表明，NETs通过结合肿瘤细胞跨膜蛋白CCDC25增强其运动性，形成保护性网状屏障以抵御免疫攻击，还能破坏血管屏障促进肿瘤细胞外渗，并与癌症血栓形成相关。这些发现使NETs靶向治疗成为癌症辅助治疗的新策略。
选择素作为介导白细胞运输与止血的关键黏附分子，其中血管内皮细胞表达的E-选择素（CD62E）可通过识别肿瘤细胞/白细胞表面的唾液酸路易斯X（sLex）结构，在结肠癌[、胰腺癌和非小细胞肺癌转移中发挥重要作用。虽然CD62E下调可抑制肿瘤转移，但其在肿瘤微环境中募集髓系细胞的具体机制仍有待阐明。
拥有五千年历史的中医药，因其疗效确切且副作用小，已成为中晚期肿瘤患者的重要补充疗法。益气活血配伍是中医抗肿瘤的经典治法，其中人参-丹参药对表现突出。人参及其活性皂苷（如Rg1、Rg3、Rb1、Rb2和原人参二醇PPD）具有免疫调节作用：Rg1可增强粒细胞抗肿瘤活性，Rg3脂质体能诱导肿瘤相关巨噬细胞向M1型转化。丹参则长期用于活血化瘀治疗，其脂溶性成分（丹参酮IIA、I及CPT）与水溶性成分（丹酚酸LA、迷迭香酸RA）均具有血管保护作用。该课题组前期发现该药对可显著抑制乳腺癌转移，该研究拟通过肺转移模型验证其抗转移效应，并深入解析其物质基础与作用机制。
结果
人参-丹参抗肿瘤效应与中性粒细胞相关肿瘤免疫微环境（TIME）的调控密切相关
01
为评估人参、丹参单用及联用的抗肿瘤效果，作者通过尾静脉注射LLC细胞构建实验性肺转移模型（图1A）。生物发光成像显示，治疗第四周时，人参组与丹参组均较模型组显著减少转移灶形成（图1B）。肺组织病理分析进一步证实，两治疗组的肿瘤浸润面积（图1C、D）、肺转移结节数量（图1E）及转移率（图1F）均显著低于模型组。值得注意的是，人参-丹参联用较单药展现出更卓越的抗转移效应。
为阐明其作用机制，作者对癌旁组织进行RNA测序。GO（BP）分析显示，差异基因显著富集于炎症免疫调控相关通路（图1G）。其中，中性粒细胞趋化作用的富集程度尤为突出。基因集富集分析（GSEA）表明，模型组中中性粒细胞迁移相关基因显著激活（图1H）。Ly6G免疫组化染色证实，模型小鼠肺组织存在大量中性粒细胞浸润，而丹参-人参联用可显著抑制该现象（图1I-J）。鉴于中性粒细胞浸润与多种肿瘤进展密切相关，作者推测人参-丹参可能通过改善中性粒细胞相关的肿瘤免疫微环境发挥治疗作用。
图1 人参-丹参调控肺组织中性粒细胞相关肿瘤免疫微环境
(A)实验设计流程图。小鼠经适应性饲养后建立实验性转移模型，按方案每日给予相应组别人参/丹参提取物，第28天采集肺组织。(B)静脉接种LLC细胞小鼠的转移灶生物发光成像图。(C)肺组织肿瘤区域H&E染色代表性图像（比例尺：50微米）。(D)肺肿瘤面积定量分析（n=3）。(E)荷瘤小鼠肺转移结节数量统计（n=15）。(F)LLC荷瘤小鼠转移发生率（n=15）。(G)对照组、模型组及人参丹参联用组差异基因GOBP分析。(H)中性粒细胞迁移相关基因集富集分析(GSEA)。(I)肺组织Ly6G免疫组化染色代表性图像及定量分析（n=3；比例尺：50微米）。(J)肺组织Ly6G免疫荧光染色代表性图像及定量分析（n=3；比例尺：100微米）。所有数据均以均值±标准误表示。####p < 0.0001 vs 对照组；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001 vs 模型组。
基于CD62E介导的中性粒细胞黏附机制发现丹参活性成分CPT
02
中性粒细胞从血管系统向远端组织的定向募集，需经历滚动、黏附及跨内皮迁移等一系列精密调控的进程。在此过程中，黏附分子与趋化因子协同发挥核心作用。值得注意的是，细胞黏附过程在富集分析中呈现显著信号（图1G），基因集富集分析（GSEA）进一步揭示模型组"白细胞-血管内皮细胞黏附"通路的显著激活（图2A）。
经人参-丹参配伍干预后，一组黏附分子表达发生显著改变，其中CD62E的下调尤为突出（图2B）。作为介导白细胞与癌细胞募集的关键黏附受体，CD62E在LLC细胞中缺乏配体的特性，促使作者推测其可能参与中性粒细胞向转移灶的定向募集。
免疫组化结果显示，丹参组对CD62E表达的抑制作用显著强于人参组（图2C）。为探究丹参成分调控CD62E的潜力，作者采用促炎因子TNF-α诱导CD62E表达，并系统评估丹参五大活性成分（水溶性成分LA、RA与脂溶性成分Tan I、Tan IIA、CPT）的干预效果。TNF-α可显著提升CD62E的mRNA（图2D）与蛋白（图2E）表达水平，而CPT与LA预处理能有效抑制此效应。细胞毒性实验显示，128μM浓度内LA对HUVECs无显著毒性（图S2A），而CPT在16μM以下浓度对内皮细胞安全性良好（图S2B）。梯度浓度测试（5/10/15μM）证实，15μM CPT对CD62E的抑制效果显著优于LA（图2F），该结论经HUVECs免疫荧光实验进一步验证（图2G）。综合来看，这些数据证明了丹参显著降低关键细胞黏附分子CD62E的表达，其中活性成分CPT表现出最显著的抑制效果。
图2 人参-丹参下调CD62E表达及丹参有效成分筛选
(A)白细胞-血管内皮细胞黏附相关基因集富集分析(GSEA)(B)黏附分子基因表达热图分析(C)肺组织CD62E免疫组化染色代表性图像及定量分析(n=3，比例尺100微米)(D)HUVECs经TNF-α刺激4小时(各化合物10μM预处理24小时)，qRT-PCR检测CD62E mRNA表达水平。右图示CPT化学结构(E-F)HUVECs中CD62E蛋白Western blot检测结果及定量分析(GAPDH作为内参)(G)HUVECs中CD62E免疫荧光染色代表性图像(比例尺50微米)。所有数据均以均值±标准误表示。#p<0.05，##p<0.01，####p<0.0001 vs 对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001 vs 模型组
CPT通过抑制CD62E介导的中性粒细胞黏附与转移灶募集
03
CD62E作为内皮细胞表面关键黏附分子，介导单核细胞与血管内皮的相互作用。为阐明CD62E在CPT抑制细胞黏附中的作用机制，作者通过慢病毒转染构建CD62E过表达（CD62E OE）的人脐静脉内皮细胞（HUVECs），经Western blot和qRT-PCR验证其高表达特性（图S3A-B）。研究发现，CD62E过表达可逆转CPT对HL-60细胞黏附的抑制作用（图3A）。在平行板流动腔实验中，分离的中性粒细胞在6 dynes/cm2剪切力下可黏附于TNF-α激活的HUVECs，而CPT预处理显著抑制此过程。值得注意的是，CD62E过表达能拮抗CPT的这种抑制效应（图3B-C及图S3C），提示CPT可能通过抑制内皮细胞CD62E表达来阻断白细胞迁移。
在体内实验中，作者通过尾静脉注射LLC细胞建立小鼠肺转移模型。与体外结果一致，CPT（25 mg/kg）治疗可显著降低肺组织CD62E的高表达（图3D-E）。CPT治疗组中ICAM1和VCAM1的mRNA表达水平亦低于模型组（图3F）。通过TIMER数据库分析发现，CD62E表达水平与肺癌组织中性粒细胞浸润呈正相关（图3G）。流式细胞术显示模型鼠肺组织中性粒细胞数量显著增加，而CPT治疗可逆转此现象（图3H）。免疫荧光结果进一步证实CPT能减少转移灶中性粒细胞浸润（图3I）。这些证据共同表明，CPT通过下调CD62E表达来调控中性粒细胞向肺转移灶的募集过程。
图3 CPT抑制CD62E介导的中性粒细胞黏附与转移灶募集
(A)HL-60细胞与HUVECs黏附实验代表性图像及定量分析(比例尺:200微米)(B)平行平板流动腔联合显微镜系统示意图(C)HUVECs表面中性粒细胞稳定黏附数量统计(D)肺组织CD62E免疫荧光染色代表性图像及定量分析(n=3;比例尺:50微米)(E)肺组织CD62E蛋白免疫印迹检测结果及定量分析(n=3)，GAPDH作为内参(F)qRT-PCR检测肺组织TNF-α、ICAM1和VCAM1 mRNA表达水平(n=3)(G)TIMER数据库分析LUAD与LUSC中CD62E表达与中性粒细胞浸润相关性(H)流式细胞术检测肺组织Ly6G+中性粒细胞代表性图像及定量(n=4)(I)肺组织Ly6G+中性粒细胞免疫荧光染色结果(n=3;比例尺:50微米)。所有数据均以均值±标准误表示。##p<0.01，###p<0.001，####p<0.0001 vs 对照组；*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001 vs 模型组
人参活性成分Rg1的发现：基于中性粒细胞NETs释放机制的研究
04
鉴于肺转移灶中中性粒细胞浸润的显著特征及其在癌症免疫调控中的关键作用，作者对肺组织分离的中性粒细胞进行了RNA测序分析。通过筛选中性粒细胞相关基因群，发现模型小鼠中一组特征性基因显著富集，而人参-丹参联用可有效下调其表达（图4B）。KEGG通路分析揭示，这些基因与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成密切相关——该机制已被证实在中性粒细胞促转移功能中起核心作用。GO（BP）分析进一步显示ERK1/2-MAPK信号级联的富集，该通路已知参与NETs生成调控（图4D）。
借助TIMER数据库的系统分析，作者发现肺癌组织中HIST3H3表达水平显著高于正常组织（图4E）。HIST3H3、ELANE和MPO的拷贝数变异与中性粒细胞浸润程度呈显著正相关（图4F-H），且这些指标的高表达与患者不良预后密切相关（图4I）。
图4 中性粒细胞RNA测序分析及NETs与肺癌相关性研究
(A)小鼠肺组织中性粒细胞分离及RNA测序流程示意图(B-C)中性粒细胞相关基因热图分析及差异基因KEGG通路富集(D)对照组、模型组与人参丹参联用组差异基因GOBP部分分析结果(E)TIMER数据库分析HIST3H3在各类癌症与癌旁组织中的表达差异(F-H)TIMER分析HIST3H3、ELANE和MPO基因拷贝数变异与中性粒细胞浸润相关性(I)TIMER分析肺癌患者HIST3H3、ELANE、MPO表达及中性粒细胞浸润与总生存期的相关性。采用双样本Wilcoxon秩和检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001 vs 对照组
基于上述发现，作者深入探究了体内NETs的形成情况。MPO、H3cit和NE的免疫荧光染色显示，人参治疗组肺转移灶中NETs的丰度显著低于丹参组（图5A-E）。为明确人参成分对NETs的抑制作用，采用PKC激活剂PMA诱导NETs形成（以DNase I为阳性对照）。50 μM人参皂苷Rg1、Rg3处理可显著抑制PMA诱导的MPO释放（图5F）。通过SYTOXTM Green染色监测DNA释放，发现除PPD外，所有人参皂苷均表现出不同程度的NETs抑制活性，其中Rg1的抑制作用最为显著（图5G）。这些结果不仅证实了NETs在塑造中性粒细胞相关肿瘤微环境中的关键作用，更揭示了人参及其活性成分（尤其是Rg1）具有靶向抑制NETs形成的药理潜力。
图5 人参-丹参抑制肺组织NETs生成及人参有效成分筛选
(A)肺组织MPO免疫组化染色代表性图像(比例尺:100μm)(B)肺组织H3cit与NE免疫荧光共定位代表性图像(比例尺:100μm)(C-E)肺组织MPO、H3cit及NE表达定量分析(n=3)(F)ELISA法检测中性粒细胞MPO释放水平，右图示Rg1化学结构(G)SytoxTM Green染色检测胞外DNA释放代表性图像及定量分析(比例尺:50μm)。所有数据均以均值±标准误表示。####p<0.0001 vs 对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001 vs 模型组
Rg1通过ERK1/2-MAPK-ROS通路抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成
05
作者进一步探究了NETosis过程中的蛋白变化。通过H3cit与NE双标记染色发现，PMA刺激诱导的NETs结构可被Rg1和DNase I显著抑制（图6A）。Western blot检测H3Cit表达水平的结果与之高度一致（图6B、C）。
为阐明Rg1抑制NETs形成的机制，作者采用ATRA将HL-60细胞诱导分化为粒细胞样细胞（dHL-60），其CD11b表达升高证实分化成功（图S4A）。CCK8实验表明，在128 μM浓度范围内，Rg1对中性粒细胞及dHL-60细胞均无显著毒性（图S4B、C）。
鉴于活性氧（ROS）与NETs形成的已知关联及Rg1的抗氧化特性，作者检测了其对ROS生成的影响。DCFH-DA荧光染色显示，Rg1预处理可显著缓解PMA诱导的ROS爆发（图6D、E）。此外，Rg1还能抑制PMA激活的ERK1/2-MAPK信号通路（图6F、G）。由此作者推测，Rg1通过调控ROS水平并阻断ERK1/2-MAPK信号通路的激活来抑制NETs形成。
图6 Rg1通过抑制ROS生成及ERK1/2-MAPK磷酸化减少NETs形成
(A)中性粒细胞NETs标志物H3cit与NE免疫荧光共定位代表性图像(n=3；比例尺：50μm)(B-C)中性粒细胞H3cit蛋白免疫印迹检测结果及定量分析(n=3)，GAPDH作为内参(D-E)流式细胞术检测dHL-60细胞(D)及中性粒细胞(E)ROS生成水平(以荧光中位强度定量)(F-G)dHL-60细胞(F)及中性粒细胞(G)p-ERK1/2、ERK1/2、p-MAPK和MAPK蛋白表达免疫印迹结果及定量分析，GAPDH作为内参。所有数据均以均值±标准误表示。#p<0.05，###p<0.001，####p<0.0001 vs 对照组；*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001 vs 模型组
体内实验进一步验证：免疫荧光共定位显示，Rg1治疗组小鼠肺组织中H3cit与NE共标的NETs显著减少（图7A），Western blot结果与之吻合（图7B）。值得注意的是，Rg1还可下调荷瘤小鼠体内中性粒细胞趋化因子（CXCL1、CXCL2和G-CSF）的水平（图7C-H），而这些因子已被证实与NETs释放密切相关。综上，该研究首次证实Rg1在体内外均能有效抑制NETosis进程。
图7 Rg1抑制肺组织NETs形成
(A)肺组织H3cit与NE免疫荧光共定位代表性图像及定量分析(n=3；比例尺：50μm)(B)肺组织H3cit及NE蛋白免疫印迹检测结果及定量分析(n=3)，GAPDH作为内参(C-E)ELISA法检测血清CXCL1、CXCL2及G-CSF水平(n=10)(F-H)qRT-PCR检测肺组织CXCL1、CXCL2及G-CSF mRNA表达水平(n=3)。所有数据均以均值±标准误表示。#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，####p<0.0001 vs 对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001 vs 模型组
Rg1逆转中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）促转移效应：抑制肿瘤侵袭、上皮间质转化及血管通透性
06
为探究NETs对肿瘤转移行为的影响，研究团队将LLC细胞分别与Rg1、PMA诱导的NETs、经Rg1或DNase I处理的NETs共培养。72小时细胞增殖未见显著改变（图8A），但侵袭实验表明：NETs可显著增强LLC细胞侵袭能力，而Rg1或DNase I处理能有效抑制此效应（图8B、C）。肺组织切片显示，Rg1治疗组中侵袭相关蛋白MMP9（亦为NETs相关中性粒细胞颗粒酶）表达显著降低（图8D、E）。
进一步研究发现，NETs通过上调间质标志物N-钙黏蛋白、下调上皮标志物E-钙黏蛋白，促进LLC细胞发生上皮-间质转化（EMT），而降解NETs可阻断这一进程（图8F-I）。
血管完整性分析揭示，中性粒细胞测序GSEA结果显示模型组血管通透性调控基因显著富集（图8L）。体外实验中，NETs增加内皮细胞对FITC-葡聚糖的通透性，抑制NETs形成则逆转此现象（图8M、N）。与模型组相比，Rg1治疗组肺血管渗漏明显减轻（图8O、P）。联合CPT治疗可协同减少中性粒细胞浸润，进一步削弱NETs在肺部的促转移作用（图S5A-C）。
综上，这些发现表明NETs通过促进肿瘤细胞侵袭、EMT进程及血管内皮通透性增强，共同构成促转移微环境，而Rg1能多靶点阻断这一恶性循环。
图8 Rg1逆转NETs诱导的肿瘤细胞侵袭、EMT及血管通透性增加
(A)CCK8法检测LLC细胞增殖活性(B)NETs分离及与LLC细胞Transwell共培养体系示意图(C)Transwell侵袭实验图像(比例尺：200μm)，以穿透细胞数及OD值定量(D-E)肺组织MMP9免疫荧光染色代表性图像及定量分析(n=3，比例尺50μm)(F)经Rg1或NETs处理的LLC细胞E-cadherin与N-cadherin免疫荧光图像(G-I)肺组织E-cadherin与N-cadherin免疫荧光定量分析(n=3，比例尺50μm)(J)NETs介导LLC细胞黏附实验示意图(K)DiI标记LLC细胞在PMA/Rg1处理中性粒细胞中的黏附荧光图像(L)中性粒细胞RNA测序分析：血管通透性调控相关基因GSEA富集(M)内皮通透性检测实验设计(N)内皮通透性实验评估Rg1/NETs对血管通透性的影响(O-P)肺组织CD31与FITC-葡聚糖共定位免疫荧光分析(n=3；比例尺50μm)。所有数据均以均值±标准误表示。#p<0.05，####p<0.0001 vs 对照组；*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001 vs 模型组
Rg1联合CPT可协同抑制肺癌体内转移
07
基于上述发现，作者进一步评估了Rg1与CPT联用对肿瘤转移的治疗效果（图9A）。治疗期间每四日监测小鼠体重，结果显示Rg1单用及联用方案均能逆转模型组出现的体重增长减缓现象（图9B）。微型CT扫描显示，联合治疗组小鼠在造模第四周时肺转移灶显著减少（图9C）。该方案不仅降低了肺转移结节数量（图9D、E），亦缩小了转移灶面积（图9F）。肝脾组织H&E染色未见明显结构损伤（图9G）。综上，Rg1与CPT联用较单药治疗能更有效抑制肺癌转移，且具有良好安全性。
图9 Rg1联合CPT抑制肺癌体内转移
(A)Rg1与CPT联合治疗实验设计示意图(B)小鼠体重变化监测(n=10)(C)小鼠肺部微型CT扫描代表性图像(D)肺转移结节数量定量分析(n=10)(E)肺组织大体观代表性图像(F)肺组织H&E染色图像及肿瘤区域定量分析(n=3；比例尺：800μm与80μm)(G)肝脾组织H&E染色代表性图像(比例尺：100μm)。所有数据均以均值±标准误表示。####p<0.0001 vs 对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001 vs 模型组
讨论
肿瘤微环境（TME）的动态变化涉及多种细胞类型和信号通路，这与中药多组分、多靶点、多通路的作用特点高度契合。近年来，中性粒细胞浸润及NETs形成在TME中的作用日益受到关注。本研究系统阐明了人参-丹参药对抑制肿瘤转移的作用机制及物质基础：人参通过抑制NETs形成、丹参通过减少中性粒细胞黏附，共同重塑免疫抑制微环境。其代表性成分Rg1与CPT联用亦表现出显著的抗转移效应。
人参-丹参配伍可有效抑制LLC肿瘤肺转移。RNA测序分析表明，该作用与调控中性粒细胞募集密切相关。黏附分子在介导中性粒细胞从血管向远端组织迁移过程中发挥关键作用。本研究发现，人参-丹参能显著下调黏附分子CD62E的表达，其中丹参的抑制作用尤为突出。
选择素已被证实参与TME塑造：通过介导肿瘤细胞-血小板-白细胞相互作用，激活内皮细胞并诱导CCL5产生，进而募集单核细胞促进转移微环境形成。Häuselmann等研究表明，CD62E高表达可促使CD11b+白细胞向肿瘤部位募集，通过调节紧密连接促进肿瘤细胞跨内皮迁移。作者从丹参中鉴定出CPT等活性成分，可抑制TNF-α诱导的内皮细胞CD62E表达，减少中性粒细胞-内皮细胞黏附。动物实验证实，CPT通过降低CD62E表达有效减少中性粒细胞肺组织浸润。
基于TME中显著的中性粒细胞浸润特征，作者进一步探究了人参-丹参对NETs的影响。肺组织中性粒细胞RNA测序提示，该药对可能调控NETs形成。NETs标志物染色显示，人参（尤以Rg1为代表）能显著抑制肺组织NETs生成。研究发现，Rg1可抑制PMA诱导的NETs释放。多种激动剂（PMA、LPS、细菌等）通过激活ROS-ERK1/2/MAPK-PI3K/Akt等信号通路诱导NETs形成。具有抗氧化抗炎特性的Rg1能抑制PMA诱导的ROS爆发及ERK1/2/MAPK通路激活。实验证实，NADPH氧化酶抑制剂（DPI）、p38 MAPK抑制剂（SB202190）或ERK1/2抑制剂（U0126）均可阻断PMA诱导的NETs形成。此外，Rg1还能下调CXCL1、CXCL2和G-CSF等促进NETs生成的趋化因子水平。
中性粒细胞在TME中形成的胞外诱捕网通过多种新机制促进肿瘤转移，包括：NET-DNA介导肿瘤细胞迁移、形成免疫保护屏障、诱导EMT及破坏血管完整性。本研究发现，NETs可增强LLC细胞侵袭能力和EMT进程。体外实验显示，NETs在肿瘤细胞周围形成网状结构可能促进远端转移，而Rg1与DNase I能有效阻断此效应。值得注意的是，Rg1还可降低血管通透性，其维持血管完整性的作用不容忽视。联合CPT治疗可进一步抑制NETs活性，较单药治疗表现出更优的抗转移效果且安全性良好。
本研究存在以下局限：首先，不能排除人参-丹参其他成分的潜在作用，其作用靶点可能具有多元性；其次，未能采用中性粒细胞敲除小鼠或PAD4基因敲除/DNase I处理进行体内反向验证；最后，不同肿瘤类型存在异质性，本研究仅采用单一肿瘤模型，需在其他模型中对人参-丹参及其配伍的治疗效果进行更广泛验证。
结论
人参-丹参配伍通过协同调控中性粒细胞相关肿瘤微环境发挥抗转移作用。丹参脂溶性成分CPT可下调内皮细胞CD62E表达，抑制中性粒细胞肺组织黏附与募集；人参活性成分Rg1则通过减少中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成，阻断肿瘤转移进程。该研究不仅为人参-丹参的临床应用提供了理论依据，更为联合抗肿瘤策略的研发提供了新思路。
参考文献
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