科研样本采集全流程指南（医学篇）
在科学研究和临床诊断中，样本采集是实验成功的关键第一步。无论是血液、尿液、唾液，还是细胞、组织、脑脊液，样本的质量直接影响后续检测的准确性和可靠性。本文系统梳理八大类生物样本的采集、处理与保存要点，助你避开实验“坑”，轻松提升数据质量！
八大类生物样本
1. 血液2. 尿液3. 唾液4. 细胞5. 组织6. 脑脊液7. 肺泡灌洗液8. PBMC细胞
样本采集量
实际采集量按照下面表格中一次实验量的3倍收集。
序号名称一次实验量1血液200 μL2尿液1 mL3唾液1 mL4细胞10^65组织50 mg6脑脊液500 μL7肺泡灌洗液1 mL8PBMC细胞10^6
特别注意
1. 标记规范：油性marker笔的正确使用与防脱落措施
要点：样本管必须使用油性marker笔（非普通记号笔）清晰标注唯一编号、采集日期及类型，避免因冷冻导致字迹模糊或脱落。
实际问题：实验室曾因冻存管标记脱落导致样本混淆，需返工重新检测。
注意事项：标注后覆透明胶带保护字迹，避免接触有机溶剂（如乙醇）；采用双重标识（如二维码标签+手写编号）。
2. 分装保存：避免反复冻融与交叉污染
要点：样本需按实验需求分装保存（如血清/血浆分装0.2 mL/管），长期保存于-80 ℃，短期可用-20 ℃或4 ℃。
实际问题：未分装的样本反复冻融导致DNA或代谢物降解。
注意事项：分装时预留备份管，防止意外损耗；使用低吸附冻存管减少残留。
3. 血清/血浆样本避免溶血
要点：根据检测目标选择抗凝剂，并且特别注意避免溶血的发生。
实际问题：误用促凝管导致凝血因子激活，影响检测结果；未能及时分离，或者对样本进行了冷冻，导致红细胞破裂，发生溶血。
注意事项：采血后轻柔颠倒混匀5-10次，避免剧烈震荡溶血。快速及时进行分离分装。
4. 记录与信息可追溯性
要点：详细记录样本采集时间、处理步骤、保存位置及异常情况（如溶血、污染）。
实际问题：信息缺失导致样本无法匹配临床数据，研究中断。
注意事项：采用电子化管理系统录入数据，避免手写错误。
5. 运输中干冰充足，保证低温未解冻
要点：足量干冰（夏天12公斤以上，其他季节10公斤，可以保证3天内不解冻；同城1天内可以减半）
实际问题：运输寄送时干冰不够，途中干冰耗尽，样本解冻后微生物滋生，检测结果异常，需重新采集。
注意事项：足量干冰，厚实的保温箱，及时跟踪快递物流。
通过规范标记、分装和运输流程，可大幅减少此类问题，提升实验效率和数据可靠性。
part1
血液样本
1. 样本采集要求
1.1 采集时间
建议在受试者空腹状态下采血（通常空腹8-12 h），避免饮食、药物或运动对代谢物水平的干扰。
1.2 采血管选择
抗凝剂：根据目标代谢物选择抗凝剂（如EDTA、肝素或柠檬酸钠），避免使用含促凝剂的普通采血管（可能干扰代谢物）。
血浆样本：EDTA或肝素抗凝管（常用）。
血清样本：需静置30-60 min待血液凝固后离心。
1.3 采血操作
避免溶血（红细胞破裂释放代谢物干扰检测），采血后轻柔颠倒混匀抗凝管，避免剧烈震荡，并记录好血液样本信息。
2. 样本处理要求
2.1 离心分离
血清：使用没有添加抗凝剂的采血管，采集2-3 mL的静脉血，静置1 h进行凝固分层，然后4000 转/分钟离心10 min左右，吸取上清中的血清保存在新的离心管中。
血浆：推荐使用肝素钠抗凝管采集全血，并尽快进行血浆分离：3000 rpm 4 °C 离心10 min，取上层溶液，0.2 mL/管分装至1.5 mL离心管中。
2.2 分装保存
分离出来的血清/血浆短期（72小时以内）保存在4 ℃冰箱中，中期（3天-1个月）保存在-20 ℃冰箱中，长期（1个月以上）保存在-80 ℃冰箱中。避免多个样品混合（交叉污染），尽量分装保存，一管保存小体积0.2 mL或者较大体积1 mL，避免反复冻融。
图1 血清和血浆的制备（原图来自参考文献1）
3. 样本保存与运输
3天内使用生物冰袋保持低温（保证冰袋不完全解冻），放入白色泡沫盒子中密封后快递。如果较长时间运输，使用干冰保持低温，即把样品管/袋和干冰混合，放入泡沫箱子里，样品的上下和四周都用干冰填满，用胶带密封后快递。一般长途运输干冰至少放置10 kg，时间不要超过72 h。
part2
尿液样本
1. 样本采集前准备
1.1 受试者样本采集前注意事项
饮食限制：受试者在尿液采集前需避免摄入可能与实验检测目的相互干扰的物质（如酒精、咖啡因、高糖/高蛋白饮食、维生素C等），必要时选择空腹采样。
药物控制：明确受试者近期用药情况（尤其是利尿剂、抗生素、激素类药物），必要时暂停可能干扰检测结果的药物（需经伦理审批）。
运动限制：样本采集前应避免剧烈运动，剧烈运动可能影响尿蛋白、肌酐等指标，建议静息30 min后再采集。
生殖卫生：女性患者应避开月经期，样本采集前应先用流水进行冲洗或用无菌湿巾清洁外阴（从前向后擦拭），男性需清洁尿道口，受试者本人需要用香皂清洁手部或用酒精进行消毒，避免污染。
1.2 样本采集容器准备
样本采集容器应使用无菌、防漏、惰性材质的专用尿杯（如聚丙烯材质），避免化学残留干扰。如需防腐剂（如甲苯、硼酸、盐酸等），需根据检测项目选择合适类型并提前预置。24 h尿液需使用大容量避光容器（2-3 L），并标注起始/结束时间，采集好的尿液应转至10-50 mL的试剂管中进行储存。
2. 样本采集流程
2.1 尿液的类型
晨尿（首次晨尿）：晨起，在未进早餐和做其他运动之前采集；患者宜卧床8 h后排尿，且尿液在膀胱中储存不少于4 h。其浓缩度高，适用于激素（如皮质醇）、代谢物（如尿糖/尿蛋白）检测。
随机尿：不受时间限制但受饮食/活动影响大，且应有足够的量用于检测，适用于常规筛查。
定时尿（如24 h尿）：特定时段采集的尿液标本（如餐后2 h尿、前列腺按摩后立即采集尿、24 h尿等），需要在采集前将尿液排空，然后采集该时段内（含截止时间点）排出的所有尿液并进行记录，主要用于定量分析（如肌酐清除率、电解质总量）。
中段尿：应弃去前段尿液，减少尿道污染，主要用于微生物培养或细胞学检测。
2.2 操作步骤
(1)中段尿采集法：
受试者排尿时弃去前1-2 秒尿液后，直接将中段尿接入无菌容器（避免接触皮肤或容器内壁）采集量建议≥10 mL（微生物检测需≥20 mL），采集后转至相应的试剂管中，并采用封口膜封口，2-8 ℃进行短暂保存。
(2)24 h尿采集法：
首次晨尿排空弃去，记录开始时间；此后所有尿液收集至专用容器（包括次日同时间点的晨尿）；全程冷藏（2-8 ℃），结束后混匀并记录总尿量，取50-100 mL样本于试管中冷冻保存。
3. 样本保存与运输
3.1 即时处理
需检测细胞或沉淀物时，4 °C下1890 rpm（对应400×g，转子半径10 cm）离心5-10 min，取上清液分装。
晨起中段尿（临床）或晨间1 h尿，3000 rpm，4 °C离心10 min，取澄清尿液，分装到离心管中，每管500 μL，做好标记后，液氮速冻15 min，-80 °C冰箱冻存。
采集的尿液样本应在2 h内完成检测，若不能及时完成，宜置于2 ℃～8 ℃冰箱保存。由于定时尿液样本中成分不稳定，若未能在2 h内完成检测，可根据检测项目选用适当的防腐剂。用于微生物检查的尿液标本宜在2 h内进行检测，若不能可将标本置于2 ℃-8 ℃冰箱保存，24 h 内仍可进行尿液细菌培养。加硼酸防腐的样本无需在2 ℃-8 ℃冰箱保存，宜在24 h内完成微生物检查。
分装：避免反复冻融，按实验需求分装至冻存管（标记唯一编码），足量干冰寄送。
3.2 保存条件
短期保存（<24小时）：4 °C冷藏。
长期保存：-20 °C（代谢物检测）或-80 °C（蛋白质/核酸分析），避免使用自动除霜冰箱。
4. 注意事项
1）若动物1 h尿量不够，可分多次收集，如果需要收取24 h尿液，请使用带有低温装置的代谢笼收取，并添加叠氮化钠（0.05～0.1 %w/v）或者使用ProClin防腐剂，并且需要及时离心，除去毛发及杂质，避免交叉污染。
2）叠氮化钠的作用是防腐杀菌，有毒，请万分小心。推荐使用ProClin防腐剂。
3）如果能够及时冷冻，则不需要添加叠氮化钠。
4）防腐剂的使用：甲苯（0.5 %体积）适用于生化检测；硼酸（10 g/L）在抑制细菌生长起到一定的作用；盐酸（6 mol/L，调节pH至2-3）主要用于儿茶酚胺、VMA检测。如应用于代谢组学研究，应避免使用防腐剂，建议采集后立即冻存于-80 °C。
图2 尿液样本（图片来自TOPDOCTORS网站）
part3
唾液样本
1. 样本采集前准备
1.1 受试者样本采集前注意事项
禁食与饮食限制：受试者在唾液采集前1 h禁食，避免摄入酸性/高糖食物（如咖啡、果汁）或刺激性物质（如烟草、酒精），若需检测口腔中微生物的含量，应在采集前12 h避免刷牙或使用漱口水。
口腔清洁：采集前用清水漱口（不可吞咽）或去离子水彻底漱口，清除食物残渣，并排空口腔唾液。避免使用含抑菌成分的清洁产品。
时间控制：检测指标中若受昼夜节律影响较大，需统一采集时间，如：皮质醇需在晨起后30 min内采集。
1.2 样本采集容器准备
使用DNAase/RNAase-free无菌离心管（建议带稳定剂，如RNAlater）进行唾液样本的收集，同时可以使用唾液采集器（适用于被动流涎或刺激分泌）进行辅助采样，若想要避免唾液黏蛋白吸附损失也可以采用低吸附移液管进行辅助采样。
注意：若检测用于蛋白质分析研究，可在采样过程中加入蛋白酶抑制剂（如PMSF）防止蛋白质的裂解，用于提取RNA样本可添加的RNA稳定剂（如RNAlater）以防止核酸降解。
2. 样本采集流程
2.1 被动流涎法（自然分泌）
受试者头部微倾，让唾液自然滴入采集管，或让唾液积聚在口腔底部，受试者每60 s将唾液吐入50 mL 离心管中，避免吞咽或混合痰液。采集量≥1 mL（儿童≥0.5 mL），防止过度刺激导致唾液成分发生变化。该方法主要用于激素（皮质醇）、代谢物或蛋白质检测。
2.2 辅助刺激法
若受试者为老年人或患有干燥综合征等唾液分泌不足的患者，可以采用咀嚼无糖胶基（如石蜡片）或舌下含服柠檬酸片（0.5 %浓度）的方式进行唾液的采集。同时需要记录刺激方式与时间，避免刺激物对实验检测的干扰（如柠檬酸影响pH值）。
2.3 口腔拭子法
将无菌棉拭子置于舌下或颊黏膜处吸附唾液。将拭子浸入保存液（如PBS）并挤压出唾液。主要用于微量样本或婴幼儿唾液的采集，同时避免拭子接触牙龈（可能混入血液）造成实验误差。
3. 样本保存与运输
3.1 样本处理与保存
样本离心：唾液收集完成后，应在4 ℃条件下，10,000×g离心10 min，去除细胞碎片和微生物，取上清液50-200 μL用于代谢物、游离DNA/RNA等检测，沉淀则用于基因组DNA或微生物组研究。
稳定剂的使用：若唾液样本用于检测DNA/RNA，则需要按比例适当加入稳定剂EDTA/RNAlater（DNA：终浓度2-5 mM / RNA：唾液：稳定剂= 1：2），抑制DNase/RNase活性，防止其降解；若用于蛋白质检测，可使用蛋白酶抑制剂（如PMSF），终浓度为1mM，从而抑制蛋白酶的水解。加入稳定剂可将样本放于4 ℃冰箱短暂保存，-20 ℃/-80 ℃适用于长期保存。而代谢物检测则采用液氮速冻的方式进行样本的保存，存于-80 ℃冰箱。
3.2 样本运输
干冰运输：将采集的唾液样本进行及时的处理后，做好标记进行包装，运输时样本需置于干冰中。使用防震包装，确保样本管密封（防止污染或泄漏）。
4. 注意事项
1）避免污染：操作者戴手套，避免手部接触采集管口。若检测微生物，需全程无菌操作。
2）干扰因素控制：记录受试者用药（如抗胆碱药抑制唾液分泌）。标注采集时间与刺激方式（影响唾液流速与成分）。
3）特殊人群：儿童/失能患者建议使用硅胶口腔拭子或吸唾器；口腔疾病患者（如溃疡）应避免采集病变区域样本。
part4
细胞样本
1.1 细胞样本裂解与采集
RNA提取（TRIzol法）：细胞诱导成熟后，去除培养基，用预冷PBS（无Ca²⁺/Mg²⁺）轻柔冲洗1次并彻底吸干，按每10 cm²（六孔板单孔）加入1 mL TRIzol并吹打至细胞完全溶解（无团块）后，转移至RNase-free管或冻存管中，-80 ℃保存。
DNA提取：使用含EDTA的胰蛋白酶对细胞（1-4×106）进行消化，3000 rpm离心5 min后弃上清，加入PBS进行细胞重悬后再次离心弃上清，沉淀细胞置于-80 ℃冻存，后续使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
miRNA提取（专用裂解液）：细胞样本收集过程同RNA提取相同，但在裂解过程中需要使用专门针对miRNA的裂解液进行裂解，后续转至RNase-free管或冻存管中，-80 ℃保存。
蛋白质提取（RIPA裂解液）：向已经收集好的细胞（同RNA）中加入200 μL 的RIPA裂解液，吹打至完全溶解，转至离心管或冻存管中，-80 ℃保存。
代谢组学检测：贴壁细胞诱导成熟后，去除培养基，用预冷PBS（无Ca²⁺/Mg²⁺）轻柔冲洗1次并彻底吸干，立即加入液氮或-80 ℃预冷的 80%甲醇/乙腈淬灭液（体积比细胞体积×3）进行代谢物的提取，或者使用细胞刮刀快速刮取细胞并转移至预冷的离心管中，4 ℃下12000 ×g离心10 min后取上清转移至新的离心管中，液氮速冻后-80 ℃保存（避免含有任何稳定剂）。而悬浮细胞则需要在清洗后，加入预冷甲醇:乙腈:水（4:4:2） 混合液（体积比细胞沉淀×5），涡旋震荡30 s ，-80 ℃直接冻存细胞悬液（后续需超声破碎提取代谢物）。
1.2 悬浮/贴壁细胞采集注意事项
悬浮细胞采集过程中依赖于离心收集，离心易标准化，适合高通量场景；而贴壁细胞的采集过程中更为复杂，在细胞收集过程中需额外增加消化步骤，如加入胰酶+EDTA消化才能使细胞脱离基质，破坏粘附蛋白；并且在裂解过程中需要反复吹打/机械刮取以保证去除残留的未脱离的细胞团块。
part5
组织样本
1. 组织样本采集及保存
动物组织：动物处死后尽量在5 min内分离目标组织（避免缺血损伤），并用生理盐水进行冲洗，滤纸吸干表面的液体，采用无菌刀片进行切分，不同组织间应更换器械（避免交叉污染）。
临床样本：手术切除后立即转移至预冷的保存液或液氮，操作过程中应避免接触消毒剂（如碘伏）或高温电刀（可能破坏生物分子）。
保存方法：样本用于RNA/miRNA检测，应在采集后将组织块完全浸没在RNAlater（4 ℃过夜后转-80 ℃）中，避免冻存前结冰；DNA/蛋白质组织样本在采集后应进行液氮速冻并转至-80 ℃冰箱进行保存，平均每管分装应≤100 mg，避免反复冻融；用于代谢组学研究的组织样本采集后直接液氮冻存，全程操作要迅速（≤1 min），防止代谢物降解；若用于病理学检测，则可以采用10 %中性福尔马林固定，室温保存即可。
2. 特殊组织处理
(1)脂肪组织：
由于脂肪组织难以被保存液渗透，所以在样本采集后应去除血管/结缔组织，采液氮速冻的方式进行保存。
(2)神经组织：
神经组织对缺氧较为敏感，可以采用快速灌注固定（动物实验）或直接液氮处理（避免缺氧损伤）进行样本的保存。
(3)肿瘤组织：
优先取边缘活性区域（避免坏死核心），分装多份用于异质性分析。
3. 注意事项
样本采集过程中应全程在冰上操作，组织从离体到冻存/固定的时间（缺血时间）应小于30 min，采集后的样本可使用铝箔纸进行包裹或置于冻存管进行液氮速冻，防止组织碎裂；同时，在整个实验过程中应详细记录组织的来源、解剖的部位、保存条件及异常情况（如出血）。
4. 样本保存与运输
根据实验检测目的的不同将采集的细胞或组织样本置于-4 ℃或-80 ℃进行保存，如需要外出寄送，应进行记录详细的样本信息及样本编号，密封完整后，干冰进行寄送。
part6
脑脊液样本
1. 样本采集操作流程
1.1 人脑脊液腰椎穿刺法采集
消毒与麻醉：受试者采用侧卧位（膝盖贴近胸部）或坐位，由专业医护人员进行局部麻醉至皮下组织，以穿刺点（L3-L4或L4-L5间隙）为中心，同心圆进行消毒（直径≥15 cm）进行穿刺采集脑脊液。
穿刺与测压：缓慢进针，见脑脊液流出后连接压力计测量初压（正常：70-180 mmH₂O）。
样本的采集：样本采集后，第1管（微生物检测）→ 第2管（生化/免疫）→ 第3管（细胞学/分子检测），每管约为1-2 mL，脑脊液抽取量应控制为：成人≤15 mL（避免低颅压头痛），儿童≤5 mL，抽取后并进行标记，记录采集时间、管号（如CSF-1、CSF-2）、检测类型。
1.2 动物脑脊液采集
麻醉与固定：小鼠/大鼠通过吸入异氟烷（4 %诱导，1.5-2 %维持），兔子通过腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉；麻醉后采取俯卧位，头部前倾（与脊柱呈45°角），固定于立体定位仪或专用支架上。
采集方法：采用枕大池穿刺法进行穿刺时，先定位到枕骨与寰椎（C1）间的凹陷处（枕大池位置），该位置5 cm内进剔除毛发，用碘伏-酒精交替消毒皮肤3次，斜45°角刺入皮肤（深度：小鼠2-3 mm，大鼠4-5 mm）缓慢回抽，见清亮液体流出后收集（小鼠10-30 μL，大鼠50-100 μL）。采用腰椎穿刺法进行穿刺时，先定位于髂嵴连线对应L5-L6椎间隙，30°角进针，突破硬脊膜后收集CSF，该方法适用于兔子或大型啮齿类动物；将采集好的脑脊液进行分装，每管为10-20 μL，避免反复冻融。
2. 样本处理与保存
由于实验检测目的的不同，对样本的处理方式存在一定的差异；如：样本用于微生物的培养，可在室温状态下立即送检，或在采集后直接接种至血培养瓶/专用培养基中，避免冷藏抑制细菌的生长；用于细胞学分析应在4 ℃下400×g离心10 min，取沉淀涂片或暂存于在4 ℃冰箱（≤24 h）；用于生化/免疫检测，需要将脑脊液进行2000×g离心10 min 后取上清，分装并冻存与-80 ℃冰箱，操作过程中避免产生溶血现象，影响蛋白浓度的测定；DNA/RNA的检测是需加入核酸稳定剂如（RNAlater，样品：稳定剂= 1：5体积），液氮速冻后转至-80 ℃冰箱，同时要禁止使用EDTA管，防止抑制PCR反应；用于代谢组学研究时，应全程冰上处理并直接分装至预冷管，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存，且操作时间应控制在5 min之内，防止代谢物降解。
3. 样本运输
根据实验检测目的的不同将采集的细胞或组织样本置于-4 ℃或-80 ℃进行保存，如需要外出寄送，应进行记录详细的样本信息及样本编号，密封完整后，干冰进行寄送。
4. 注意事项
1）应严格执行无菌操作，避免皮肤或毛发落入样本，并且在专业人员的指导下进行相应的操作。
2）优先处理微生物检测样本（时效性强），在处理样本的过程中避免剧烈震荡，防止细胞破裂或蛋白变性。
3）若受试者为高颅压患者，禁忌进行腰椎穿刺，需结合影像学评估后进行决策。
4）若脑脊液出现轻微的血污，可短暂离心出去红细胞，严重污染需要舍弃。
图3 收集脑脊液（原图来自MEDICOINFO网站）
part7
肺泡灌洗液
1. 样本采集流程
1.1 人肺泡灌洗液样本采集方法
麻醉：患者咽喉局部麻醉后，导入纤维支气管镜。
灌洗部位：将支气管镜顶端楔入目标肺段或亚段支气管开口，避免大气道分泌物混入。
灌洗液选择：使用37 ℃或室温的无菌生理盐水，总量100-300 mL，分3-5次注入，每次20-60 mL。
负压吸引：注入生理盐水后，立即用适当的负压（一般低于100 mmHg）吸引回收灌洗液，总回收率应≥30 %。
标本收集：回收的灌洗液需用无菌容器收集，第1管回收液建议单独处理，根据检测目的不同进行分装，成人标本量应不少于10 mL，儿童不少于3 mL。
样本采集容器：用于病原学分析的标本需用无菌容器；细胞学分析需选择硅化塑料或玻璃容器，以减少细胞黏附。
1.2 动物肺泡灌洗液样本采集方法
气管插管：对小鼠/大鼠剃毛后进行皮肤消毒，纵向切开颈部皮肤，分离肌肉暴露气管，用钝头针穿刺气管，插入导管并固定。
肺泡灌洗：缓慢注入预热的生理盐水（小鼠0.5-1 mL/次，大鼠3-5 mL/次）。
液体回抽：轻柔回抽注射器，回收灌洗液（回收率60-80%），重复2-3次，合并灌洗液。
2. 样本保存与运输
2.1 样本处理
采集后的样本通过100 μm细胞筛去除黏液或组织碎片，在4 ℃下400×g离心10 min，分离上清液（蛋白、细胞因子）和细胞沉淀。
用于细胞学分析建议保存于4 ℃（≤24 h）条件下，沉淀细胞用PBS重悬，进行涂片或固定；蛋白质检测建议取部分上清液加入蛋白酶抑制剂（1 mM PMSF）后分装-80 ℃保存；RNA/DNA分析则需要取适当的沉淀细胞并加入RNAlater（1:5体积比）， 液氮速冻；代谢组学研究建议取上清液直接进行液氮速冻，-80 ℃保存，禁止使用添加剂。
2.2 运输要求
根据实验检测目的的不同将采集的细胞或组织样本置于4 ℃或-80 ℃进行保存，如需要外出寄送，应进行记录详细的样本信息及样本编号，密封完整后，干冰进行寄送。
3. 注意事项
1）需充分麻醉，抑制咳嗽反射，避免支气管黏膜损伤出血。
2）生理盐水需预热至37 ℃，避免冷刺激导致支气管痉挛。
3）缓慢注入和回抽，防止支气管腔塌陷或肺泡破裂，血性样本需弃用或标记。
4）全程使用无菌器械，临床支气管镜需严格消毒，动物操作时避免插管过浅（误入食管或口腔）。
图4 肺泡灌洗液（BAL）样本采集（原图来自参考文献16）
part8
PBMC
1. 样本采集前准备
1.1 采集时间
建议受试者在空腹状态8-12 h下采血，避免血脂干扰分析效果，同时要对近期用药如：免疫抑制剂或化疗药进行详细记录，严重贫血或凝血功能障碍的患者慎用。
1.2 采血管选择
抗凝血的采血管种类繁多，但肝素（绿色）和柠檬酸钠（蓝色）抗凝管最适合用于人外周血单个核细胞（PBMC）的采集；EDTA抗凝管（紫色）主要是通过钙螯合抑制凝血，而钙螯合在抗原特异性再刺激期间可能会损害细胞因子诱导，一般为备用方案。
采集后的样本应在室温（20-26 ℃）条件下，储存不超过8 h。
肝素抗凝管（推荐）
柠檬酸钠抗凝管（推荐）
EDTA抗凝管（备用）
图5. 采血管选择（图片来自Bing image）
1.3 采血操作
一般成人采血量应控制在5-10 mL（外周血），儿童则需减半，采血后轻柔颠倒混匀抗凝管，避免剧烈震荡，并记录好血液样本信息，PBMC的最佳分离时间应控制在采血后2 h内，随着时间的推移，细胞的活力降低。
2. 样本处理流程
PBMC的分离一般采用密度梯度离心法（Density Gradient Centrifugation），该方法是国际公认的标准方法，核心原理是利用不同血细胞的密度差异实现分离，可去除95%以上的红细胞和粒细胞，使得PBMC纯度≥90%。细胞存活率可到达到90%以上（温和离心条件减少机械损伤）。具体操作流程如下：
稀释血液：将抗凝血与无菌PBS（含2%胎牛血清）按1:1比例混合。
分层离心：先向离心管中加入一定体积的Ficoll-Paque PLUS（密度1.077 g/mL）或其他等效淋巴细胞分离液，取稀释血沿离心管壁缓慢叠加于Ficoll液之上，Ficoll液与稀释血体积比为2:1。
离心条件：室温条件下，400×g，离心30-35 min。
吸取白膜层：将上层血浆移去，用移液管轻柔吸取界面处的白膜层（含PBMC）后转移至新的离心管中。
洗涤细胞：向装有PBMC的离心管中加入PBS（含2% FBS），250×g离心10 min，弃上清。重复洗涤2次，最终用PBS或不含血清的培养基重悬细胞。
图6. PBMC提取流程图（图片运用 BioGDP.com所作）
3. 样本的检测应用
3.1 DNA检测
将分离好的PBMC采用酚-氯法或商业试剂盒直接提取DNA，避免冻融导致DNA断裂，确保DNA分子的完整性；提取好的DNA样本可以通过Nanodrop进行浓度测定，一般确保A260/A280在1.8-2.0之间代表DNA质量较好，通过琼脂糖凝胶电泳观察条带完整性进行质量控制。
3.2 RNA检测
将分离好的PBMC中立即加入RNA稳定剂（如RNAlater，1:5体积比）或TRIzol试剂进行裂解，能够快速稳定RNA，提取好后的RNA使用Qubit进行浓度定量，-80 ℃长期保存，避免反复冻融。
3.3 蛋白质检测
使用含蛋白酶抑制剂（如1 mM PMSF）和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液对分离后的PBMC进行快速裂解，操作时间控制在10 min内，避免蛋白质降解；通过BCA法进行蛋白质浓度的测定，SDS-PAGE检测蛋白质的完整性。
3.4 代谢组学检测
将分离好的PBMC立即投入液氮或加入预冷淬灭液（80%甲醇/乙腈，-80 ℃预冷）。避免使用添加剂：如叠氮化钠、抗凝剂等，防止对质谱检测产生干扰。可以检测标志代谢物（如ATP、乳酸）的稳定性（降解率应<10%），进行质量控制。
4. 样本保存与运输
4.1 短期保存
若采集的样本用于流式细胞术或功能实验，可将细胞悬液暂存于4 ℃冰箱（≤24 h）。建议使用含10%胎牛血清的RPMI 1640，防止细胞贴壁。
4.2 长期冻存
将细胞沉淀与冻存液（10% DMSO + 90% 胎牛血清）按1:1混合（终浓度5×10⁶/ mL），之后采用程序降温的方式进行保存：4 ℃（30分钟）→ -20 ℃（2小时）→ -80 ℃（过夜）→ 液氮长期保存。后续可以通过37 ℃水浴快速解冻后，立即加入预温培养基洗涤。
4.3 运输时间
常温运输的方式是仅限于4小时内送达（细胞悬液+冰袋，2-8 ℃），否则需要干冰覆盖（≥3 kg干冰/24 h），标注“生物样本·勿倒置”字样进行冻存运输。
尽量分装保存，一管保存小体积0.2 mL或者较大体积1 mL，避免反复冻融。
5. 注意事项
5.1 无菌操作
实验全程应在生物安全柜内操作，避免微生物污染。且分离液和PBS使用前需恢复至室温（18-25 ℃）。
5.2 关键操作细节
离心过程中要保持离心机升/降速平稳，避免破坏分层界面。DMSO终浓度严格应控制在10 %，毒性过高或过低保护都不足以保护细胞的完整性。
5.3 特殊需求
免疫分型：分离后立即标记抗体（避免抗原内化）。代谢组学：液氮速冻（禁用防腐剂），全程操作≤5 min。
总结
样本采集是科学研究和临床诊断的基础环节，规范的操作和严格的注意事项是确保样本质量的关键。无论是血液、尿液、唾液，还是细胞、组织、脑脊液或肺泡灌洗液，每一步都需谨慎对待。从抗凝管选择到液氮速冻，从无菌操作到分装标记，每个细节都需精益求精。
牢记 “三快原则”：快速取材、快速处理、快速冻存。
让您的实验结果更可靠、更可重复！
希望本文的详细介绍能为您在实验和临床实践中提供参考，帮助您的研究和诊断工作顺利进行。
参考文献
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27. 静脉血液标本采集指南（WS/T 661—2020），2020年10月1日
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28. 王蓓丽, 郭玮, 潘柏申. 卫生行业标准《WS/T 661—2020 静脉血液标本采集指南》解读 . 中华医学杂志, 2021, 101(21) : 1610-1613. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20210223-00467.
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