血糖异常与非酒精性脂肪肝病的双向因果关联研究：基于北京市健康管理队列
非酒精性脂肪肝病（NAFLD）指除长期大量饮酒和其他明确的肝损伤引起的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的肝脏代谢性疾病［1-2］。目前，NAFLD是全球最常见的慢性肝病，其发病率和患病率在世界范围内迅速上升，全球范围内成年人的患病率约为25%［3-4］。我国NAFLD患病率在20年间也在持续增长，21世纪初患病率为23.8%，在2018年增长到32.9%［5］。然而，NAFLD发病隐匿、无特异性的临床症状和体征，诊断NAFLD的“金标准”仍然依赖于肝活检，但活检很难获得，目前检测脂肪肝的方法主要依靠肝脏的超声成像检查，但这只能作为定性指标；此外，有研究指出主要基于常规实验室和人体测量指标的肝脂肪变性指数（HS）作为与NAFLD病变程度相关的连续性指标在不同人群中已被证明具有良好的诊断准确性［6-7］。
血糖异常是全球最大的公共问题之一，与各学科疾病密切相关，并发症的发病率和死亡率较高［8］。根据2018年国际糖尿病联盟（IDF）发布的全球糖尿病地图显示，2017年全世界有4.51亿例糖尿病患者，到2045年预计增加到6.93亿例［9］。近30年，我国糖尿病患病率显著增长，从2013年的10.9%上升到2018年的12.4%［10-11］。另外，大多数患者在发展为完全糖尿病之前都会经历一个糖尿病前期阶段，是由正常糖代谢向糖尿病转化的过渡阶段，此阶段患者血糖值比血糖正常者高，但未达到糖尿病诊断标准，是糖尿病预防重点对象［12］。
NAFLD和血糖异常之间的关系在国内外队列研究中已被证实［13］，有研究结果表明，NAFLD会增加2型糖尿病的发病风险［14］，另有研究结果表明，2型糖尿病会增加NAFLD的发病风险［15］，但目前缺乏二者之间是否存在双向时序关联的研究。因此，本研究基于北京市健康管理队列以交叉滞后面板模型分析NAFLD与血糖异常之间的双向时序关系，以期为两种疾病的预防或减缓疾病的发展提供新的证据，从而减轻两种慢性疾病带来的疾病负担。
1 对象与方法
1.1 研究对象
本研究对象基于北京市健康管理队列研究，该项目采用队列研究设计，通过整群抽样选取固定功能单位人员，数据收集时间自2016年1月，每年随访1次，随访至2021年12月。收集研究对象的问卷与体格检查相关信息，其中问卷中涉及内容包括：（1）基本情况如性别、年龄、教育程度、职业、BMI等；（2）生活行为因素如吸烟、饮酒、运动情况、工作活动强度等指标；（3）用药史和疾病家族史。体格检查包括身高、体质量、腰围、臀围、血压及血液生化指标的检测，包括空腹血糖（FPG）、尿酸（UA）、三酰甘油（TC）、总胆固醇（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、丙氨酸氨基转移酶（AST）、天冬氨酸氨基转氨酶（ALT），另外通过对常规指标的计算来获取HS数据。本研究获得了首都医科大学伦理委员会的伦理批准（编号：2019SY088），每位参与研究的患者均已签署书面知情同意书。
1.2 纳入与排除标准
本研究队列基线共纳入66 774名体检者，排除未成年、失访者以及过量饮酒者、服用降糖药者、基线及随访信息缺失者后，最终纳入44 838名研究对象（图1）。纳入标准：（1）同意参与项目研究，并签署知情同意书。配合填写调查问卷、进行体格检查，留取血液样本，有唯一识别码；（2）年龄≥18岁；（3）有基线和随访两个时间点的数据且肝功能和血糖指标信息齐全。排除标准：（1）失访者；（2）基线或随访服用降糖药者；（3）过量饮酒者（男性乙醇摄入量≥30 g/d，女性≥20 g/d）；（4）基线或随访时服用调脂药。
1.3 疾病以及主要指标的定义
（1）NAFLD。根据超声结果诊断NAFLD，超声结果检出以下表现时诊断为脂肪肝：肝脏前场回声增强（“明亮肝”），远场有衰减回声；肝内管道在结构上相对模糊。并且排除以下几种情况：男性乙醇摄入量≥30 g/d，女性≥20 g/d；患有酒精性脂肪肝、基因3型丙型病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝豆状核变等特定肝病；使用特定药物；患有全胃肠外营养、炎症性肠病等特定疾病［16］。（2）血糖异常。根据中华医学会糖尿病学分会制定的《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）（上）》，FPG>5.6 mmol/L可以诊断为血糖异常［17］。（3）高血压：根据《中国高血压防治指南（2018年修订版）》，高血压定义为收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）或舒张压≥90 mmHg［18］。（4）血脂异常：根据《中国成人血脂异常防治指南（2016年修订版）》，满足TC≥6.2 mmol/L、TG≥2.3 mmol/L、LDL-C≥4.1 mmol/L、HDL-C <1.0 mmol/L中任意一条即可诊断为血脂异常［19］。（5）运动程度：划分为从不、偶尔（未达到1次/周）和经常（1次/周及以上）。（6）吸烟：是否吸烟的定义是目前为止吸烟数量≥100支。
1.4 研究方法
本研究采用HS［HS=8×ALT/AST+BMI（如果是女性+2）［20］］和FPG这两个连续性变量来代替NAFLD与血糖异常二分类变量，构建交叉滞后面板模型，同时考虑NAFLD与血糖异常相互作用的正反两个方向，校正自相关和同步相关，研究NAFLD与血糖异常的双向时序关系。
在进行交叉滞后分析之前，利用残差分析方法构建研究变量与基线和随访时的含性别、年龄、BMI的回归方程，并保留相应残差进行对数转换处理以符合正态分布，经Z转换（均值=0，标准差=1）进行标准化处理［21］。
利用自助抽样方法（Bootstrap）方法估计参数的置信区间，验证交叉滞后面板模型参数估计值的稳定性。若自助抽样方法获得的置信区间不包括0，则说明有统计学意义。交叉滞后面板模型见图2，其中r1为x和y的基线同步相关系数，r2、r3为x和y的自相关系数，β1、β2为交叉路径系数，交叉滞后路径系数即为判断两变量间时序关系的依据，包含以下几种情况：若β1=0，β2=0，则x，y之间 不存在时序关系；若β1≠0，β2=0，且两系数差异有统计学意义，则两变量为x基线→y随访的单向时序关系；若β2 ≠0，β1=0，且两系数差异有统计学意义，则两变量为y基线→x随访的单向时序关系；若β1≠0，β2 ≠0，则两变量为相互调控的双向时序关系［22-24］。采用均方根残差（RMR）和比较拟合优度指数（CFI）对模型进行评价，当模型拟合参数RMR<0.05，CFI>0.90时，表示模型拟合较好。同时，性别和BMI是NAFLD和血糖水平的重要影响因素，因此按照性别分为男性、女性，同时根据WHO推荐的标准将BMI分为<25.0 kg/m2与≥25.0 kg/m2［25］，探索不同人群中NAFLD与血糖异常的时间顺序关系。
1.5 统计学方法
采用R 4.2.2统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用成组t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；等级资料比较采用Wilcoxon秩和检验；双向时序关系的分析采用交叉滞后面板模型进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 研究对象的基线特征
44 838名研究对象中位随访时间为2.96年，基线中位年龄为38.0（31.0，48.0）岁，其中男22 738名，女22 100名，BMI≥25.0 kg/m2有17 697名，BMI<25.0 kg/m2有27 141名。
2.2 总人群中NAFLD与血糖异常的双向关联
校正基线和随访时的性别、年龄、BMI、是否吸烟、运动程度、是否患高血压以及是否患血脂异常之后，在总人群中，HS与FPG两次测量的自相关系数分别为0.536（95%CI=0.528~0.544）和0.655（95%CI=0.648~0.662），基线同步相关系数为0.091（95%CI=0.082~0.100），均有统计学意义（P<0.05）。从基线HS到随访FPG的交叉滞后路径系数β基线HS→随访FPG为0.009（95%CI=0.002~0.016），有统计学意义（P<0.05）；从基线FPG到随访HS的交叉滞后路径系数无统计学意义（P>0.05），如图3所示。提示HS单向影响FPG，HS的变化在FPG之前，即存在由NAFLD到血糖异常单向的时间序列关系。模型评价指标RMR为0.014（<0.050），CFI为0.995（>0.900），表明模型拟合情况较好。
2.3 按性别分层后NAFLD与血糖异常的双向关联
在女性中，校正基线和随访的年龄、BMI、是否吸烟、运动程度、是否患高血压以及是否患血脂异常之后，HS与FPG两次测量的自相关系数分别为0.459（95%CI=0.448~0.471）和0.623（95%CI=0.613~0.634），基线同步相关系数为0.097（95%CI=0.084~0.111），均有统计学意义（P<0.05）。从基线HS到随访FPG的交叉滞后路径系数β基线HS→随访FPG为0.025（95%CI=0.015~0.035）；从基线FPG到随访HS的交叉滞后路径系数β基线FPG→随访HS为0.026（95%CI=0.014~0.038），均有统计学意义（P<0.05），如图4所示。提示在女性中，HS与FPG存在双向关系，即存在NAFLD与血糖异常之间的双向时间序列关系。模型评价指标RMR为0.016，<0.050，CFI为0.993，>0.900，表明模型拟合情况较好。而在男性中，无论是从基线HS到随访FPG的交叉滞后路径系数还是从基线FPG到随访HS的交叉滞后路径系数，均无统计学意义（P>0.05）。
2.4 按BMI分层后NAFLD与血糖异常的双向关联
在BMI≥25.0 kg/m2的人群中，校正基线和随访的年龄、性别、是否吸烟、运动情况、是否患高血压以及是否患血脂异常之后，HS与FPG两次测量的自相关系数分别为0.641（95%CI=0.629~0.652）和0.648（95%CI=0.637~0.659），基线同步相关系数为0.068（95%CI=0.054~0.083），均有统计学意义（P<0.05）。从基线HS到随访FPG的交叉滞后路径系数β基线HS→随访FPG为0.114（95%CI=0.103~0.125），有统计学意义（P<0.05）；从基线FPG到随访HS的交叉滞后路径系数无统计学意义（P>0.05），如图5所示。提示在BMI≥25.0 kg/m2的人群中，HS单向影响FPG，HS的变化在FPG之前，存在由NAFLD到血糖异常单向的时间序列关系。模型评价指标RMR为0.028（<0.050），CFI为0.978（>0.900），表明模型拟合情况较好。
在BMI<25.0 kg/m2的人群中，校正基线和随访的年龄、性别之后，HS与FPG两次测量的自相关系数分别为0.611（95%CI=0.602~0.620）和0.631（95%CI=0.622~0.640），基线同步相关系数为0.065（95%CI=0.053~0.077），均有统计学意义（P<0.05）。从基线HS到随访FPG的交叉滞后路径系数β基线HS→随访FPG为0.101（95%CI=0.092~0.111），有统计学意义（P<0.05）；从基线FPG到随访HS的交叉滞后路径系数β基线FPG→随访HS为0.021（95%CI=0.012~0.031），如图6所示。提示在BMI<25.0 kg/m2的人群中，HS与FPG存在双向关系，即存在NAFLD与血糖异常之间的双向时间序列关系。模型评价指标RMR为0.024（<0.050），CFI为0.984（>0.900），表明模型拟合情况较好。
3 讨论
本研究基于北京市健康管理队列，在大型体检队列中探索NAFLD与血糖异常的双向时序关系。分析结果表明，在总人群中，NAFLD会增加血糖异常的发病风险；在女性中，NAFLD与血糖异常会存在双向因果关系，相互影响；而在男性中，二者之间的因果关联尚没有统计学意义；在BMI≥25.0 kg/m2的人群中，NAFLD会增加血糖异常的发病风险；在BMI<25.0 kg/m2的人群中，二者存在双向时序关系，相互影响。这说明相比于男性，NAFLD与血糖异常的因果关联作用在女性中似乎更为明显；而在非肥胖人群中，二者存在双向时序关系，似互为因果关系。以往的研究常在队列中分别探究NAFLD对2型糖尿病的影响或是血糖异常对NAFLD的影响。2020年，在一项基于中国社区居民的队列研究中显示，2型糖尿病患者NAFLD发生概率增加了3倍以上（OR=3.58，95%CI=2.80~4.58，P<0.001）［15］。同时，也有队列研究中表明NAFLD会增加血糖异常的发生风险。2021年，中国厦门市的一项队列研究表明，NAFLD与糖尿病发生的风险增加独立相关，调整后OR为2.02（95%CI=1.47~2.77）［26］。但缺少二者之间的双向时间因果关联研究。而本研究在同一队列中以交叉滞后面板模型分析了两者的时序关系。
另外，本研究按性别和BMI进行了分层分析。按性别分层结果表明，在女性中，NAFLD与血糖异常会存在双向因果关系，相互影响，而在男性中，二者之间的因果关联没有统计学意义。推测男女分析结果不同的可能原因，一是女性的荷尔蒙水平发生变化，包括雌激素和孕激素水平，在整个月经周期和生命阶段（如妊娠、绝经）都会发生波动，这些激素变化会影响糖代谢和胰岛素敏感性［27］。二是本研究人群的男性与女性相比BMI差别较大，可能是因为女性的生活方式（饮食习惯、体重管理等）与男性存在区别，这对NAFLD和血糖异常的发展都有重要影响。按BMI分层后，在BMI≥25.0 kg/m2的人群中，存在NAFLD增加血糖异常的发病风险的单向因果关系，而在BMI<25.0 kg/m2的人群中，二者存在双向因果关系，相互影响，在BMI较高人群中二者关系不明显，提示BMI对研究结果可能有混杂作用，应进行更深入的研究。其中可能的原因是肥胖与胰岛素抵抗之间存在关联，胰岛素抵抗可以导致血糖升高，进一步增加血糖异常的风险，肥胖是2型糖尿病的一个主要风险因素［28］。而在非肥胖的人群中，存在相对较低的脂肪积累和较低程度的胰岛素抵抗，这使得NAFLD和血糖异常之间的关系更为复杂，轻度的NAFLD可能通过一定程度的胰岛素抵抗增加血糖异常的风险，同时，血糖异常也可能导致肝脏脂肪堆积，这种相互影响可能是两者呈现双向因果关系的原因。不同人群中存在的差异需要进一步的研究来深入了解这些机制，以便更好地预防和管理NAFLD和血糖异常。
本研究和国内外研究中均显示NAFLD与血糖异常之间存在关联，但目前其生理机制还没有完全确凿的证据，有研究表明，NAFLD和血糖异常之间的联系可以通过一系列代谢变化来描述，这些代谢变化以胰岛素抵抗、肝脂质谱缺陷、导致脂肪堆积、免疫反应或由2型糖尿病β细胞功能障碍导致的高胰岛素血症为代表［29-30］。
也有研究认为除了以上机制，氧化应激和炎症也与两者的发生发展有关［31］。胰岛素抵抗可以影响NAFLD的发生，这主要是由于胰岛素抑制脂肪组织脂肪分解的能力受损，导致向肝脏运送的游离脂肪酸增加［32-33］，以及通过固醇受体结合蛋白1-c（SREBP-1c）刺激脂肪生成酶导致的脂肪生成增加［34］。进入肝脏的游离脂肪酸增加，进而导致脂肪毒性，表现为内质网应激，随后肝细胞损伤并凋亡［35］。肝脏氧化应激和线粒体功能障碍也会促进胰岛素抵抗，从而导致NAFLD发展为纤维化［36］。也有研究表明，遗传和环境因素可能与代谢紊乱相互作用，加速糖尿病患者NAFLD进展［13］。
4 小结
本研究结果表明在女性和BMI<25.0 kg/m2的人群中，NAFLD与血糖异常会存在双向因果关系，这说明在女性和非肥胖人群中，NAFLD可能与2型糖尿病互为因果，相互影响，可以为临床上对两种疾病采取共同防治的治疗思路提供线索，但在BMI≥25.0 kg/m2的人群中，NAFLD会增加血糖异常的发病风险更明显，说明在肥胖人群中患有NAFLD的人群更容易血糖异常从而患有2型糖尿病，应注意对血糖的控制以预防2型糖尿病的发生。
本研究的优势在于：第一，基于大规模体检人群队列运用交叉滞后面板模型对NAFLD与血糖异常二者之间的双向时序因果关系进行探索；第二，分层阐述了两种疾病互为因果的关系，可以对两种疾病采取共同防治，也为揭示NAFLD与血糖异常之间的生理机制提供了线索；第三，NAFLD与血糖异常都与心血管疾病的发生发展相关，因此对于两种疾病的关联及共同防治有望减缓心血管疾病的发生。同时，本研究也存在一些局限性：首先，本研究用HS作为连续性指标来代替NAFLD，虽然NAFLD的诊断“金标准”为肝脏活检，但HS作为肝脏脂肪变性的检测指标已经在临床或研究中被广泛使用；其次，本研究没有考虑胰岛素抵抗与炎症状态可能对NAFLD与血糖异常二者之间的关系产生的影响；最后，本研究人群来自中国北京市，由于地区、种族和生活方式的差异，本研究结果有一定的局限性，能否推广到中国或其他地区未来还需要更多大规模纵向研究来验证。希望以上的问题在进一步研究中得到解决。
参考文献略
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