阿斯利康：小分子及大分子生物药可开发性新趋势与新挑战

发布于 03-12 · 浏览 1212 · IP 上海上海

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新文章又来了，药物开发漫长而艰难。有句号话说的很好啊，良好的开端是成功的一半。那么新药的开端在哪呢，多半在选择疗效，安全性，稳定性达到一定平衡的临床前候选化合物吧。那么如何选择到这样的化合物呢，随着药物研发沉重积淀（因为花钱买经验）和实践，国际巨头不断的在响应挑战与机遇，药物可开发性提到的次数也越来越多。正如本文所写的那样，不断的总结与概括，不停的评估与权衡，速战速决或许可以减少投入成本过多，从而陷入更深的泥潭！如果觉得文章不错，转发一下呗！

摘要：在后基因组时代，成药性和可开发性空间正在迅速发展。过去，Lipinski的五法则（Ro5）出现，并作为传统可成药靶点空间中口服给药的药物样分子设计的指南。相比之下，在这个新时代，药物发现正在向结合和调节具有挑战性的生物靶点的新方法转变，从而为患者带来变革性的治疗。因此，使用各种新兴分子模式，即Ro5（bRo5）以外的小分子（如蛋白质-蛋白质相互作用调节剂、蛋白质靶向嵌合体或PROTACs）、多肽/多肽模拟物和基于核酸的模式，对新靶点进行药物治疗已成为药物发现的重点。在本文中，并排讨论了新兴的成药性和可开发性空间，以建立对这些新模式的潜在开发挑战的一般理解。概述了不断发展的新靶点和分子模式，然后详细分析了成药性方面以及用于开发候选药物的策略，以及用于评估可开发性的趋势化学和制剂策略。

介绍

可溶性和可开发性是发现和开发新化学实体中的两个重要概念，这些概念通常仅限于小分子，但近年来已扩展到生物药和核酸。从历史上看，“成药性”（描述靶标可及性和配体参与的能力）一直是发现科学家在早期药物发现和设计阶段的主要关注点（1,2,3）。另一方面，“可开发性”可以被描述为候选药物特性的一组复合特性，这些特性导致其能够被递送到靶标并引发反应，随着分子在进入临床之前进行临床前开发，开发和发现科学家会进行评估（4,5,6,7,8，9,10,11）。在当前的药物发现范式中，成药性考虑因素与可开发性同时评估，因为发现和开发团队合作讨论靶点特性，并建立用于候选药物给药途径的最佳物理化学和生物药剂学特性。

成药性的概念是通过Hopkins和Groom在2002年发表的“可成药基因组”出现的（1），从那时起，在2005年至2008年期间，三个成药性术语紧随其后：“可成药蛋白”、“可成药口袋”和“热点成药性” “druggable protein”, “druggable pocket”, and “hot spot druggability”（2）。有关Chengability的定义和随时间演变的更多详细信息，请参见Hussein等人的一篇出色的综述文章（2），该文章的分析基于2002年至2015年间发表的16篇文章（2）。在这里，成药性被定义为“生物靶标与具有高亲和力的化学实体相互作用以对患者产生治疗益处的能力”（1,2,3）。

传统上，制药行业一直专注于开发具有既定靶点（可成药靶点）的口服生物可利用小分子。根据2期药物的物理化学特征，1997年开发了Lipinski的5法则（Ro5）（12）。Ro5预测，当氢键供体超过5个（HBD>5）、超过10个氢键受体（HBA>10）、分子量大于500Da（MW>500）且计算的LogP大于5（cLogP>5）时，吸收或渗透不良的可能性更大。从那时起，Ro5一直作为药物发现过程中设计可开发分子的指南。虽然发现与已建立的“可成药”靶点相互作用的小分子Ro5化合物的努力是富有成效的，但对创新的需求也在增加，以吸引变革性药物的新靶点（13,14,15）。因此，新型生物靶点的鉴定和验证已成为药物发现早期阶段的重点。随着基因组学、蛋白质组学（16,17）以及蛋白质核磁共振（NMR）和晶体结构测定（CSD）（18）等表征技术的进步，人们对与不同疾病相关的蛋白质调节有了更深入的了解，很明显，这些传统上难以处理的靶标需要新的化学实体（19,20,21,22,23).这些化学型包括但不限于单克隆抗体（mAb）和其他蛋白质试剂、肽、Ro5以外的小分子（包括蛋白质靶向嵌合物（PROTAC））和基于核酸的治疗药物。虽然mAb等生物制剂旨在以高亲和力和选择性结合特定靶标表位，是细胞外或细胞表面靶标的成熟模式（1），但非生物新型化学模式旨在获取和调节细胞内基因组蛋白和当代药物靶标（23,24）。

设计、开发和交付这些新颖的模式往往超出了现有技术的范围（25,26,27）;因此，发现科学家面临着前所未有的可开发性挑战（28）。然而，创新科学和技术正在成功地帮助这些新型方式进入临床和市场（20,29-46），这表明需要药物科学的发展来管理和解决这些新出现的挑战。如上所述，可开发性与成药性明显不同，可开发性可以定义为“分子在理化性质、固体形式、配方、体内性能、可制造性、开发风险和患者便利性方面开发为成功候选药物的能力”（4,10,11）。

成药性是一个比可开发性更新的概念。如图1所示，成药性的概念出现在2000年代初期，从那时起，引用“成药性”的出版物数量迅速增加。另一方面，可开发性则显示出不同的特征。引用“可开发性”的出版物数量在1982年至2002年期间稳步增长，然后在2003年至2005年期间达到约600篇出版物的峰值，在引入Lipinski的Ro5后，当时传统药物靶点主导了药物发现。从那时起，关于可开发性的出版物的流行率一直保持稳定状态。尽管如此，随着科学家推进科学和技术的发展，将新兴的多样化和新颖的分子模式开发成治疗以前难以治疗的目标的药物，预计对可开发性的关注将再次上升。

图1 1982年至2018年期间，SciFinder©数据库中使用检索词“成药性”或“可开发性”的出版物数量

虽然许多综述文章分别讨论了成药性和可开发性的概念，但本文的目的是同时讨论这两个主题，以了解用新兴方式对新靶点进行药物治疗的机会、成药性挑战以及克服这些挑战的化学或药物策略。应该强调的是，不断发展的成药性和可开发性空间需要各个学科在药物发现和开发方面更紧密的合作，才能将新药成功推向市场。虽然单克隆抗体（mAb）和蛋白质（16）等生物制剂在调节新靶标空间方面发挥着重要作用，但本出版物的重点是化学修饰的新模式和不断发展的小分子药物空间。

新靶点和分子模式分析

在后基因组时代，药物发现已转向将新的设计原则应用于分子或新策略，以结合、调节或降解未来创新药物中具有挑战性的生物靶点。图2.概述了药物发现中的新靶点空间、发现策略和多样化的化学空间。如图所示，这些新兴药物发现策略涉及非酶靶标的直接调节，例如蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）、泛素依赖性蛋白质降解以及通过基于核酸的方式调节蛋白质合成。相应的分子模式包括通过非传统作用模式（例如，蛋白质-蛋白质相互作用或PPI调节剂）的bRo5小分子、双功能bRo5小分子（例如，蛋白质靶向嵌合体或PROTAC）、肽/肽模拟物和寡核苷酸（ON）（22,25,26）。bRo5小分子和肽都是为PPI设计的，其中大多数在PPI中，PPI位于细胞内，需要药物穿过细胞膜才能发挥作用（24,47）。另一方面，PROTAC和ON适用于更广泛的生物空间（22），因为它们通过消除蛋白质或中断细胞调节中心的蛋白质合成来调节靶标。所有新模式都有一个共同点，即它们通过更新的机制或细胞内的相互作用来调节以前无法成药的靶标的蛋白质。

图2概述药物发现中的新靶点空间、发现策略和多样化的化学空间，这些靶点能够对以前无法成药的靶点进行蛋白质调节

在后续部分中，将同时从成药性和可开发性的角度讨论这些新靶点和相关模式。

bRo5小分子，例如PPI调节剂

PPI是药物发现的重要靶标类别，因为它们代表了细胞内外的大量靶标（100,000–1,000,000）。这些PPI的目标表面通常大而平坦（补充1），使其不能用传统小分子成药（48,49）。随着靶标表面的延伸程度越来越高，结构结合位点的复杂性增加（补充2）导致设计具有高亲和力和选择性的分子面临重大挑战。临床上的大多数PPI抑制剂都有集中在小结合口袋中的热点残基（初级结合结构），相互作用的蛋白质在表面具有短序列，例如cIAP/SMAC和溴结构域/组蛋白。具有二级结构的PPI更复杂，但被认为可被小分子或肽/肽模拟物处理，其中靶蛋白通常有2-3个子口袋，这些子口袋作为通过与伙伴蛋白partner proteins（例如Bcl家族/BH3和MDM2/p53）的疏水相互作用结合的热点。此外，三级结构结合位点是不连续的，可能是设计具有所需效力的分子（例如IL-2/IL-2Rα和HPV-11E1/E2）最具挑战性的靶标（47）。

由于对这些新靶标的结合结构的理解不断深入，人们对设计bRo5小分子的兴趣正在上升（19,20,21,26,50,51）。从历史上看，bRo5药物出现在免疫学、传染病、肿瘤学和心血管领域。近年来，这一趋势仍在继续，2014年至2016年期间批准了12种新的口服bRo5药物，占同期批准总数的21%，比历史上的6%增加了15%（20）。这些分子的分子量通常>500Da，以克服较大接触表面的分布式自由能（50,52）。它们还包含大量的氢键受体（HBA）和供体（HBD），以促进与PPI界面热点的有效结合相互作用，尽管HBD规则在2014年至2016年期间最近批准的口服药物中一直符合Ro5要求（20）。或者，由肽亚基组成的修饰肽/拟肽物非常适合PPI靶标，将在后续部分中讨论。

尽管最近药物批准有所增加，但由于低渗透性、低溶解度和/或高代谢清除率导致整体药代动力学特性不佳，bRo5化学物质的开发仍然是一个高风险，并且具有很大的不确定性。此外，关于它们作为活性摄取/外排转运蛋白底物的潜力的有限知识增加了另一层复杂性（20）。维奈托克Venetoclax（一种一流的Bcl-2抑制剂）作为每日一次口服片剂（53）获得批准，表明具有次级结构结合位点的PPI靶点（47）可以用小分子成药。值得注意的是，Bcl-2靶标于1986年被发现，科学家们花了20年时间、三个主要候选药物和两轮临床试验才将维奈托克带给患者（53）。毫无疑问，维奈托克的发现是广泛化学努力的结果，这在其他地方有描述（20）。

维奈托克（补充3）显然是一种bRo5化合物（分子量：868g/mol;cLogP：10;HBA：14;HBD：3）（20）物理化学性质差，例如低溶解度、中等但知之甚少的渗透性和高外排（补充4）（20,54）。这些特性对口服给药提出了重大挑战。维奈托克作为口服药物成功的原因有很多方面。首先，其极高的效力（细胞杀伤EC50=8nM且Bcl-2结合Ki<0.01nM）保证在400mg的可行口服剂量下有效（20）。其次，它的淋巴运输途径，如狗所证明的那样（补充5）（29）和积极的食物效应确保了患者有足够的口服暴露（54）。最后，它的低熔点和在脂质和有机溶剂中的合理溶解度使脂质制剂可用于临床前研究，并将无定形固体分散体用于监管毒理学和临床研究。这个例子表明，高效可以缓解口服bRo5化合物的一些物理化学挑战。

bRo5PROTAC

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是维持细胞稳态的细胞机制的一部分。PROTAC代表了一种新兴的新型平台/策略，可以劫持UPS机器以降解致病蛋白（55,56）。如图3所示，这种机制需要PROTAC分子的一部分与泛素化蛋白复合物的E3连接酶部分结合，另一部分与靶蛋白结合，通常使用不同的接头连接。传统的PROTAC底物（56）在补充3中表示。PROTAC可以反复指导靶分子的泛素化，因此，它们的作用机制是催化性的，甚至在亚化学计量浓度下有效（57）。效力，通常以DC50表示（靶蛋白降解50%的浓度）在皮摩尔和低纳摩尔范围内报道（27,58,59）。

图3 PROTAC和蛋白质降解机制（Ub=泛素，红色箭头描绘PROTAC分子）

迄今为止，在鉴定出的至少600种E3泛素连接酶（33）中，只有少量E3泛素连接酶靶标已成功使用PROTAC技术，例如vonHippel-Lindau病抑癌基因蛋白（VHL）、小鼠双分钟2同源物（MDM2）、细胞凋亡抑制剂（IAP）和大脑（CRBN）。剩下的一个挑战是，每个E3连接酶都需要单独处理，因为每个E3连接酶具有不同的生物学、结构和功能特征（60）。

PROTAC是小分子，其特性牢牢植根于bRo5空间，例如，分子量为700–1400Da，logP值高达11（27,61）。在最近对2014年至2019年间发表的73篇文章中的422种降解剂（包括PROTAC）的分析中，Maple等人（57）发现，平均而言，除了氢键供体的数量外，降解剂违反了Lipinski的所有规则。这些结构特性可能导致水溶性差和渗透性差，从而导致口服吸收困难。然而，高效力可以补偿低生物利用度汇聚到合理的口服剂量中（58,62）。此外，PROTAC可能提供更高的特异性（23,62）、更长的药效学效应（23）以及更广泛的细胞类型和动物模型适用性（23）。

最近，前两种PROTACARV-110和ARV-471以口服剂型进入临床（30,31）。由于它们的结构尚未披露，其人体生物利用度尚未报告，因此目前无法进行生物药剂学评估。尽管如此，对结构特性的分析表明，一些PROTAC可能比其他PROTAC更适合口服吸收（27）。在口服给药不可行的情况下，采用注射途径，例如皮下、腹膜内或静脉内（27）。

根据每种PROTAC所需的药代动力学（PK）/药效学（PD）/疗效要求，可能需要替代制剂。靶向蛋白的合成速率对维持所需PD效应和疗效所需的稳态暴露持续时间（例如，C_ss4小时与24小时）有显着影响。延长血浆半衰期或更高剂量和/或缓释制剂可实现更长的覆盖持续时间（27）。

未来PROTAC模式的可开发性尚未得到证明。感知到的长合成路线、具有多个立体中心的结构复杂性以及潜在的非结晶性可能会使药物开发过程严重复杂化。此外，严格的化学、制造和控制（CM&C）考虑和商业规模的可制造性可能需要新的策略来简化其开发（23）。

多肽/多肽模拟物

多肽具有选择性和强效性（通常为EC50在皮摩尔或纳摩尔范围内）信号转导分子，这些信号转导分子在结构上模拟调节靶蛋白的内源性蛋白/肽（22,63）。历史上，多肽被定义为具有2-50个氨基酸的多肽，在人体生理学中发挥着关键作用，如激素、神经递质、生长因子、抗菌剂等。迄今为止，已有60多种肽（主要是信号转导通路的激动剂）已获得监管部门的批准（22,32）。此外，>200种多肽处于临床前开发阶段，~170种多肽候选药物在肿瘤学和代谢疾病领域处于临床评估阶段（33）。表I显示了2014年至2018年间批准的非胰岛素多肽的例子（33,34,63）。如图所示，肽类药物体积大，分子量>1000Da（超出Lipinski的Ro5）。由于肽键的存在，水溶性通常不是大多数肽的问题，这可能导致代谢稳定性差，特别是肽酶降解，以及通透性（肠道或细胞）随后限制它们跨多个膜屏障的递送，包括口服递送。因此，大多数肽是注射给药的。

表I 2014年至2018年期间批准的非胰岛素多肽示例

名称

批准年份

靶点/适应症

批准国家/地区

MW（daltons）

分子类别

给药途径/剂量信息

Afamelanotide(Scenesse®)

2014

体激素α-MSHEPP的合成形式

欧盟

1647

线性

SC/16mg每2个月一次，建议每年3次种植，每年不超过4次

Dalbavancin(Dalvance®)

2014

革兰氏阳性微生物/ABSSSI

1814

Cyclic

静脉注射/1000mg，然后1周后服用500毫克

Oritavancin(Orbactiv™)

2014

脂糖肽抗菌药/ABSSSI

1989

Cyclic

IV/1200mg单剂量

Lixisenatide(Adlyxin®)

2016

GLP-1受体激动剂/2型糖尿病

4859

线性

SC/10mcg每日一次

GalliumGa68dotatate

2016

用于SRPNET的放射性诊断显像剂/PET

1436

Cyclic

体重IV/2MBq/kg（0.054mCi/kg）至200MBq（5.4mCi）

Abaloparatide(Tymlos®)

2017

人PTHrP（1-34）类似物/PWO

3961

线性

SC/80mcg每日一次

AngiotensinII(Giapreza™)

2017

脓毒性或其他分布性休克

1046

线性

静脉注射/20纳克/千克/分钟

Etelcalcetide(Parsabiv®)

2017

CaS受体激动剂/继发性HPT

1048

线性

静脉注射/5毫克，每周3次

Macimorelin(Macrilen™)

2017

成人GHD的GHSR激动剂/诊断

535

线性、假肽

PO/0.5mg/kg单次口服

Plecanatide(Trulance®)

2017

GC-C激动剂/慢性特发性便秘

1682

Cyclic

PO/3mg，每日一次

Semaglutide(Ozempic®)

2017

GLP-1受体激动剂/2型糖尿病

4114

线性

SC/0.25mg每周一次

LutetiumLu177dotatate(Lutathera®)

2018

放射性标记的生长抑素类似物/SRPGEP-NETs

1610

Cyclic

IV/7.4GBq（200mCi）每8周一次，共四剂

关键：皮下注射、静脉注射、口服或口服、α-MSHα-黑素细胞刺激素、EPP红细胞生成性原卟啉症、ABSSSI急性细菌性皮肤和皮肤结构感染、GLP-1胰高血糖素样肽 1、PET正电子发射断层扫描、SRP生长抑素受体阳性、NETs神经内分泌肿瘤、PTHrP（1-34）甲状旁腺激素相关肽、患有骨质疏松症的绝经后妇女、CaS钙感应、HPT甲状旁腺功能亢进症、GHSR生长激素促分泌素受体、GHD生长激素缺乏症、GC-C鸟苷酸环化酶-C、GEP-NETs胃肠胰神经内分泌肿瘤

为了解决天然多肽的快速蛋白水解问题，多肽药物发现正在探索肽模拟物的新化学空间。在这里，模拟多肽被定义为保留肽键的修饰肽，例如，修饰的线性和环状肽、stapled/稳定肽、双环支架和肽折叠聚体（22,64）。为了简化本出版物中的命名法，环肽、stapled/稳定肽和双环支架在后续讨论中均称为“环肽”。如前所述，模拟肽物非常适合处理历史上占主导地位的细胞外激素受体（例如PPI）之外的一系列具有挑战性的靶标，因为它们具有良好的分子特性（26）。目前，有40多种环肽药物在临床上使用，平均每年有一种新的环肽药物进入市场（34）。尽管大多数临床批准的环肽来源于天然产物，但两个最先进的拟肽例子balixafortide（补充3）和ALRN-6924为科学家们提供了对未来用于肠胃外和口服给药的合成修饰肽的开发信心（34,65）。

非口服多肽递送

虽然大多数获批的肽疗法是注射给药的（22,32），但也有一些是通过鼻内或口服途径给药的。在注射肽中，通过皮下（SC）或肌内（IM）注射的长效产品（例如，每月一次的奥曲肽长效制剂）为患者提供了更高的便利性和依从性（例如，奥曲肽溶液需要每月注射60-120次）。长效作用可以通过配方或化学设计来实现。例如，奥曲肽是一种高效肽，被配制成可生物降解的微球，以在每月肌内注射后实现延长药物释放。另一方面，albiglutide、liraglutide和semaglutide等GLP-1肽在化学上都是长效的，使用脂肪酸部分，并通过与白蛋白结合来延长半衰期（66）。在文献中可以找到应用于GLP-1产品的构效-活性-关系（SAR）和配方策略的精彩总结（67），并描述了每种新产品如何通过长效皮下注射和最近的每日口服产品来提高疗效和便利性而脱颖而出。或者，工业和学术研究人员正在探索局部、透皮、微针、口腔、鼻腔、肺和眼部输送系统，以提高患者的便利性（63,68）。例如，布舍瑞林、降钙素（鲑鱼）、去氨加压素和催产素用于鼻内给药，而lucinactant则用于气管内给药。

用于局部递送的口服多肽

利那洛肽是一种14个氨基酸的合成肽，是为数不多的已被开发成具有局部药理作用的口服产品的肽之一（69）。利那洛肽经过化学修饰，不仅可以提高肠上皮细胞管腔表面与鸟苷酸环化酶-C（GC-C）受体的结合亲和力，还可以提高胃肠道稳定性（69）。口服给药时，利那洛肽在胃肠道（GI）局部起作用，全身暴露最小。配制的利那洛肽（Linzess®）包含填充到硬明胶胶囊中的速释包被珠子（36）。

用于全身递送的口服多肽

口服多肽递送以产生全身作用极具挑战性（37），市场上只有少数获批的治疗方法（35）。正如文献（37）报道的那样，两种成熟的口服肽，去氨加压素和环孢菌素，由于其独特的分子特性而具有活力。通常，对于多肽的口服递送，可能需要化学优化和制剂策略来解决与GI生理学相关的转化挑战，特别是稳定性和渗透性（37）。

据报道，为设计用于口服递送的线性和环状模拟肽进行了大量的化学工作（22,33,64,70）。通过引入非天然氨基酸（aa），如D-aa、N-Me-aa、α-Me-aa、β-aa，可以在肽骨架中修饰天然线性肽，以提高蛋白水解稳定性并延长半衰期（33）。然而，这些修饰可能导致不良构象和结合亲和力降低。或者，通过氢键替代物、stapling, and hairpins形成的环化通过建立构象刚性来提高结合亲和力和选择性，显示出比线性对应物更大的潜力（33）。此外，环状肽模拟物通过屏蔽易受蛋白酶敏感的骨架酰胺显示出更好的蛋白水解稳定性，并通过侧链修饰、N甲基化和/或β支化增加亲脂性来增强膜通透性（33,70）。这些循环结构也可能提供变色龙特性，这将有助于被动膜渗透（71,72,73）。尽管如此，在化合物设计阶段，必须在溶解度和渗透性之间保持微妙的平衡（50）。

除了化学工作外，使用吸收增强剂的配方设计也引起了人们对口服多肽递送的巨大兴趣（74）。最近，semaglutide已于2019年9月获得FDA批准，用于使用这种方法口服递送人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的7-37肽片段的类似物。

索马鲁肽是一种设计合理的肽类药物，具有高效力（GLP-1REC50：6.2pM）（74）和延长血浆半衰期，每周皮下注射仅0.5或1mg剂量（66）。其骨架中的化学修饰（63）增加了其白蛋白结合，有效地创造了活性化合物的循环库，减少了肾脏清除率和代谢降解，并增加了酶稳定性（74）。此外，口服semaglutide片剂与无活性的小分子增强剂salcaprozatesodium（SNAC）共同配制，其瞬时增加semaglutide的胃跨细胞吸收（没有任何证据表明对紧密连接有影响），提高溶解度，并通过局部缓冲作用防止酶降解（74,75).尽管口服生物利用度仅为1%左右（2期临床数据），但semaglutide的高效力显示出与皮下给药semaglutide相似的疗效（血糖控制和体重减轻）（74）。SCsemaglutide每周给药一次，而口服片剂需要每日给药和剂量滴定（38）以维持长时间暴露。同样，据报道，使用专有的瞬时渗透增强剂（TPE®）技术（76）的联合制剂用于口服奥曲肽胶囊Mycapssa®，该胶囊刚刚于2019年6月完成一项关键试验，宣布该试验达到主要和次要终点（39）。

基于核酸的治疗药物

基于核酸的药物，特别是寡核苷酸（ON），通过在核酸或基因水平调节靶蛋白，为获取未被治疗的靶标提供了独特的机会。在过去的30年中，ON取得了显着进展，第一个ASO（反义寡核苷酸）Vitravene™（福米韦森）于1998年获得批准，第一个适配体Macugen®（培加他尼）于2004年获得批准，第一个小干扰核糖核酸（siRNA）药物Onpattro®（patisiran）于2018年获得批准（40,77）。FDA批准的ON的分子特性和剂量信息如表II所示。

表II FDA批准的ON：分子特性和剂量信息

批准的ON

分类

分子量（Da）

目标/疾病区域

批准年份

剂量信息

Vitravene®(Fomivirsen)

ASO（PS linkage）

7122

mRNA/CMV视网膜炎

19981999（EMEA）

pH8.7/玻璃体内注射/330μg诱导剂量每隔一周注射一次，共2剂，诱导后每4周一次

Macugen®(Pegaptanib)

适配子（PS linkage）

50,000（包含40kDaPEG取代基）

视网膜VEGF165/AMD

2004

pH6-7溶液/玻璃体内注射/0.3mg，每6周一次

Kynamro®(Mipomersen)

ASO（PS linkage）

7595

mRNA/HoFH抗体

2013

pH7.5–8.5/SC/200毫克，每周一次

Exondys51®(Eteplirsen)

ASO（PMOlinkage）

10,306

前mRNA/DMD

2016

pH7.5/IV/30mg/kg，每周一次

Defitelio®(Defibrotide)

聚脱氧核糖核苷酸

13,000–20,000

蛋白质/肝脏sVOD

2016

pH6.8–7.8/IV/6.25mg/kg每6小时静脉输注2小时，至少21天

Spinraza®(Nusinersen)

ASO（PS linkage）

7501

mRNA/SMA抗体

2016

pH7.2溶液/鞘内注射/12mg前3次负荷剂量，间隔14天，第4次负荷剂量在第3次给药后30天;每4个月一次维持剂量

Onpattro®(patisiran)

siRNA芯片

14,304

遗传性TMD的mRNA/多发性神经病

2018

用于静脉输注的pH7.0脂质复合物溶液/0.3mg/kg每3周一次

Tegsedi®

(Inotersen)

ASO（PS linkage）

7601

遗传性TMD的mRNA/多发性神经病

2018

pH7.5–8.5溶液SC/284mg，每周一次

GivlaariTM(givosiransodium)

siRNA-GalNAc偶联物

17,246

mRNA/AHP抗体

2019

溶液SC/2.5mg/kg每月一次

关键：PS硫代磷酸酯、PMO磷酸二酰胺吗啉寡聚体、AMD年龄相关性黄斑变性、CMA巨细胞病毒、DMD杜氏肌营养不良症、HoFH纯合子家族性高胆固醇血症、SMA脊髓性肌萎缩症、SSO剪接切换 ONs、sVOD严重静脉闭塞性疾病、TMD转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性、TTR人甲状腺素运载蛋白、AHP急性肝卟啉病，皮下皮下注射，静脉注射

ON疗法按其作用机制可分为三大类（22）：（i）靶向RNase-H或剪接转换或ASO外显子跳跃介导的基因敲低的单链ASO;（ii）进入RNAi通路的双链siRNA或miRNA;（iii）mRNA和基于规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的疗法簇，以调节蛋白质功能或产生。大多数基于ON的疗法通过调节致病基因的表达来阻止蛋白质的产生（78）。

ON通常很大，ASO的分子量为4-10kDa，siRNA的分子量为~15kDa，CRISPR相关蛋白9/单向导RN（CRISPR-Cas9/sgRNA）的分子量为~200kDa，mRNA的分子量为~700-70,000kDa。作为高电荷大分子，ON的口服生物利用度较差，主要通过静脉内或皮下途径给药。目前，大多数获批的ON是ASO和siRNA（表II）。

目前，细胞摄取和胞质递送是在ON的潜力完全实现之前仍有待解决的关键挑战（41）。进入血液后，ON被血清核酸酶降解，并通过肾脏和肝脏清道夫受体过滤（79）。作为带高度负电荷的大分子，ON没有被动扩散穿过脂质双层的能力，因此它们的细胞摄取非常有限（80）。虽然裸露的ASO可以通过内吞作用被细胞吸收（81），但它们中的大部分（>99.9%）可以被困在内体中。它们释放到胞质溶胶中，在那里可以发生作用机制仍然是一个挑战。为了改善其药物样和组织靶向特性，需要对ASO（82,83,84）和siRNA（85,86,87）进行化学修饰。此外，它们中的大多数需要递送载体才能成功摄取和胞质递送（42）。这些新型递送制剂是保护ONs免受核酸酶降解、最大限度地减少免疫反应（基于脱靶效应的种子区域）和提高组织特异性所必需的（42,88）。

单链ASO

化学修饰的ASO可以通过内吞作用进入细胞，并能够从内体逃逸到细胞浆和细胞核中（81）。如表II所示，所有市售的ASO都具有硫代磷酸盐（PS）键，而不是天然磷酸二酯键（P=O），后者在循环过程中可在血清核酸酶中迅速降解。ASO中的PS骨架对血清核酸酶的水解具有显著的抵抗力，因此在循环过程中具有更高的稳定性（89）。此外，ASO中的PS骨架可以与血清白蛋白和其他细胞内蛋白结合，这些蛋白可以增加药代动力学（PK）特征，并能够在不需要任何递送系统的情况下自行递送到肝外组织（82,83,90）。其他用于提高效力、结合亲和力和/或代谢稳定性的化学修饰（主要是核糖中的2′-修饰）包括用2′-O-甲氧基乙基取代2′-羟基

2'-M-Oethoxyethyl（MOE）、2'-O-甲基（2'-OMe）或bicycle2-，4'-O-亚甲基桥（即锁定核酸：LNA）（84）。目前，超过100种具有广泛2'修饰和PS取代骨架的ASO正在临床试验中进行评估（91）。另一个值得注意的反义化学涉及用中性磷酸二酰胺吗啉代低聚物（PMO）替换阴离子糖骨架。Eteplirsen是一种PMOASO，于2016年被FDA批准用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）（92）。表II中目前市售的ASO可溶于水性介质，并以简单的水溶液形式给药。

最近批准的ON药物inotersen是具有20个核苷酸的2'-MOEPSASO的一个例子。它通过靶向TTRmRNA抑制人转甲状腺素蛋白（TTR）蛋白合成，适用于治疗成人遗传性转甲状腺素蛋白介导的（hATTR-PN）淀粉样变性多发性神经病（93）。Inotersen被批准每周SC给药，但由于血小板减少症需要血小板监测（93）。此外，它还需要在腹部、大腿上部区域或上臂外侧区域之间旋转，以尽量减少注射部位的反应（43）。Inotersen被配制成预充式注射器中的水溶液（pH7.5–8.5），旨在输送1.5mL（284mgInotersen总剂量）。通常高剂量的PSASO（如inotersen）是由于肝细胞中的胞质和细胞核递送需求，以及它们通过PS介导的清道夫受体摄取优先在非实质肝细胞（例如肝窦内皮细胞、kupffer细胞和星状细胞）中积累（44）。改善肝细胞中ASO摄取的一种方法是通过GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶联，该偶联可以将效力提高10倍以上（94）。据报道，GalNAc偶联物通过快速唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）介导的内吞作用被肝细胞选择性摄取。Asgpr受体在肝细胞中过表达（每个细胞10个6个拷贝），受体周转率快~10-15分钟，能够在肝细胞中快速摄取和内化（95）。在肌肉、肾脏、眼部和神经退行性疾病等治疗领域，ASOs的肝外递送也需要这种类型的组织特异性靶向（92,96）。

双链RNA（例如siRNA、miRNA）

siRNA或miRNA必须在胞质溶胶内递送，在那里它们与靶标mRNA形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），然后沉默靶基因。裸露的双链RNA必须经过化学修饰，以提高血清稳定性、降低免疫原性并增强效力（97）。典型的修饰包括用2'-O-甲基（2'-OMe）或2'氟（2'F）残基取代核糖中的2'羟基，读者可以查阅文献报告以了解其他化学策略（85,86,87）。Patisiran是FDA批准的第一个siRNA药物，用于与inotersen相同的疾病领域，其批准标志着药物干预新时代的开始。

Patisiran是一种双链21聚体，具有部分2′-OMe修饰的寡核苷酸，包含正义（passenger）链和反义（guide）链（98）。它于2018年被批准每3周静脉输注一次，剂量为0.3mg/kg（33），距离1998年发现RNA干扰（RNAi）近20年（99）。Patisiran会导致肝脏中编码TTR蛋白的mRNA敲低（93），并且由于脂质纳米颗粒（LNP）中二亚油酰甲基-4-二甲基氨基丁酸酯（一种可电离氨基脂质）的免疫原性问题，需要用类固醇进行预处理（45）。

与ASO相比，siRNA只需递送到胞质溶胶中，这可以通过递送载体（例如脂质纳米颗粒、GalNAc偶联物）完成（100）。Patisiran配制在脂质纳米颗粒（LNP）中，并悬浮在用于静脉输注的水性缓冲液中。LNP是一个四组分系统，由用于siRNA封装的可电离氨基脂质、用于膜融合性的磷脂酰胆碱、用于结构完整性的胆固醇和用于siRNA保护和所需生物分布的聚乙二醇化磷脂组成（101,102）。优化RNA递送的LNP已经发展了几十年，它们可能是最有效的RNA递送系统（42,102）。使用当前的LNP设计，siRNA的剂量水平可以达到低至~0.1–0.01mg/kg，并且可以在肝细胞中实现>95%的基因敲低（94）。应该认识到，基于LNP的递送系统可在肝细胞中有效摄取siRNA，但此类系统仍可能对靶向递送至肝脏以外的组织构成挑战。虽然patisiran的成功证明了siRNA疗法的成功实施，但其持续成功还需要在递送系统方面进行更多开发。最近的一篇综述（88）将肾脏描述为使用全身性RNAi递送靶向的下一个可能组织（88）。这种方法的一个例子是QPI-1002，这是一种3期临床候选药物，是一种靶向p53的siRNA，用于预防心脏手术后的急性肾损伤（AKI）和相关影响（95）。

与ASO类似，另一种将siRNA递送至肝细胞的简单、直接的方法是GalNAc介导的递送。虽然GalNAc偶联的siRNA如何从内体逃逸的确切机制尚不清楚，但只有一小部分递送的GalNAc-siRNA（<0.01%）被释放到胞质溶胶中。尽管分数很小，但该水平足以在肝细胞中诱导非常有效的RNAi介导的基因敲低。迄今为止，>15种基于GalNAc的偶联物处于临床试验的不同阶段，givosiran于2019年11月获得FDA批准（103），而inclisiran成功完成了3期研究，成功达到主要和次要终点（46）。

mRNA和CRISPR-Cas9向导RNA

mRNA和CRISPR-Cas9向导RNA的分子比siRNA大得多;因此，它们的递送具有挑战性，尤其是在Cas9蛋白或Cas9mRNA和短向导RNA（sgRNA，~100个核苷酸长度）需要双重递送的CRISPR递送领域。虽然Cas9mRNA的递送可以通过LNP解决，但Cas9蛋白和sgRNA复合物（即核糖核蛋白复合物）的封装需要新的配方技术。目前，>15种基于mRNA的药物处于针对各种适应症的1期试验中，其中最先进的是处于2a期临床试验中的VEGF-AmRNA（104）。

当前临床产品计划分析

与上面说明的药物示例一样，制药格局的转变也反映在临床开发产品计划的数量上（补充6和7）。截至2019年5月，临床管道中注射产品的总项目数量为10,364个，其中28%（2859）被归类为小分子，很可能位于bRo5空间中（补充6）。当代临床管道还显示了基于多肽和核酸的模式的富集（补充6）。有趣的是，临床开发中的注射产品数量（10,364）已超过口服项目（7224）（补充7）。增加的注射治疗可能会降低患者的依从性，这可以通过长效产品来解决，将给药频率降低到至少每周一次或更长时间。或者，纳米医学方法可以改善治疗窗口、降低总剂量并减少给药频率（105）。

分子模式的开发风险

随着发现科学家扩大他们的竞争领域并增加分子模式以提高靶点成药性，制药科学家在将新模式转化为创新药物方面面临着前所未有的挑战。表III对bRo5、多肽和ONs这三种化学类别与药物特性、体内性能和药物递送相关的开发风险进行了一般评估。该评估基于本出版物中报告的文献综述和作者的集体经验。如颜色图例所示，随着颜色从绿色变为红色，开发风险从“低”增加到“非常高”。此外，问号“？”用于表示存在潜在风险和我们的科学知识存在差距的房产。从便利性的角度来看，口服给药在整个行业被认为是患者首选的给药途径。如表III所示，此处讨论的所有分子模式都存在口服吸收挑战，因为它们沿胃肠道的通透性差。多肽和ON是最具挑战性的口服递送，因为它们的细胞通透性差，酶稳定性差。表III中表示的信息被来自不同学科的科学家在项目的不同阶段大量利用，以指导先导化合物优化、临床前和临床开发。

表III分子模式的药物特性、体内性能和药物递送方法的开发风险评估

讨论

如前几节所强调的，新兴的分子模式给开发带来了重大风险（表III）。因此，制药行业所处的复杂靶点和分子空间需要在药物发现过程中化学、生物学、药物代谢和药代动力学以及制药科学小组之间建立重要的跨学科合作，才能在药物开发中取得最终成功。这些集体努力旨在加深对靶标生物学、化学物质、PK-PD关系、药品和制剂过程的更深入理解，并建立更多使能的技术或平台来支持项目决策和进展（106）。

图4说明了各种分子模式在化学解决表III中确定的关键问题的能力以及用于解决这些问题的替代给药途径和配方策略的选择方面的战略趋势。如图4所示，当确定新化学系列或肽的胃肠道稳定性和渗透性等主要问题时，构效关系（SAR）分析应该是解决这些问题的第一步，如本出版物中涵盖的所有药物示例所示。同样值得注意的是，这里展示的所有实例都是高选择性和高效力的，补偿了低口服生物利用度，并实现了合理的口服剂量（37）。接下来，考虑对不具有口服生物利用度的化合物进行注射给药，例如大多数多肽和ON。然后，相应地探索长效、微/纳米颗粒以及其他新技术，因为这些技术有可能通过提高患者的便利性和依从性来解决关键挑战，例如细胞内通透性、稳定性或分化。在此过程中，制药科学家在影响化学工作以设计具有药学优势的分子和定义目标产品概况方面发挥着关键作用（106）。目前对不同给药途径的最佳分子性质空间和一般配方原则的理解可以在文献中找到（106,107）。

图4说明了各分子模式在化学处理能力方面的战略趋势，以解决表III中确定的关键问题，以及用于解决这些问题的替代给药途径和制剂平台的选择

对于ON来说，策略可能有所不同，因为递送系统至关重要。与小分子和多肽一样，ON需要化学修饰和GalNAc偶联，然后探索不同的递送系统（图4）。在后一种情况下，需要大量的配方工作才能使配方能够进行早期临床前评估。特别是，新型制剂载体需要仔细评估和设计每种特定ON的辅料，因此需要发现和制剂科学家之间的密切合作，并在早期药物发现阶段整合制剂选择、疾病知识和靶点选择。因此，在临床前开发过程中需要额外的资源来优化每个分子的配方，这些配方通常需要生产过程可扩展以确保临床可转化性。未能使用可扩展的制造工艺确定稳定、稳健的配方将导致所有临床前研究的相当大的延迟和可能的重复，因为配方是分子达到其靶标能力不可或缺的一部分。

值得注意的是，所有渗透性差的新兴分子模式（表III）的口服给药仍然是一个重大挑战，需要突破性创新、最先进的化学和配方设计，以增强肠道渗透性。使用GastroPlus®软件版本9.5（SimulationsPlus，Inc.）生成的100mg剂量的小分子的通透性敏感性模拟如图所示（补充8）。该图的目的是显示低于0.3×10^-4cm/s的肠道通透性如何显着影响吸收剂量的分数（%）。通常，肽和bRo5分子的渗透率明显低于该值。根据Yang和Hinner（108）的说法，细胞的被动渗透性与分子量和极性成反比。使用通透性增强剂的自然摄取机制和制剂策略可用于跨细胞膜转运分子，从而实现这些具有挑战性的方式的口服递送（37）。然而，高受试者间和受试者内差异是这种方法的常见问题，对于分子量超过1000Da的分子，口服生物利用度可能为个位数。换句话说，通透性增强技术可能仅适用于高效且PK变化较小或具有广泛治疗指数的分子。一种有趣的给药策略包括使用注射负荷剂量，然后是随后的口服剂量，以维持疗效所需的全身暴露（38）。这仅适用于具有适当PK特性的分子，并且需要开发和供应注射和口服产品。

一种新兴的输送技术涉及可吞服的装置，这些装置将分子封装在针头中，并在口服给药后将针头插入胃肠道（实际上是肠道注射）。例如，RaniPill已在人体中显示出经过验证的安全性，目前正在进行临床开发（109）;SOMA（自定向毫米级涂抹器）已成功完成临床前研究（110）。这些技术，以及许多其他技术（6,37），可以解决其他渗透性增强方法的高可变性，并提供高比例的给药剂量。然而，总剂量可能很小（1-3mg），并且药物递送效率、长期安全性、商品成本和患者接受度等关键问题仍然存在。

还值得注意的是，尽管由于核酸的成功化学修饰和药物递送系统的先进发展，基于ON的药物似乎正在成为药物发现的主要参与者，但在进行后期临床研究时必须谨慎，因为已在ON药物患者中观察到血小板减少症和肝毒性等不良事件。令人鼓舞的是，最近使用GalNAc-siRNA偶联物inclisiran的3期数据显示RNAi在大量患者群体中的长期安全性。因此，随着ASO和siRNA的持续临床成功以及基于mRNA和CRISPR的疗法的治疗潜力，寡核苷酸治疗的新时代已经到来。一旦解决向肝外组织的输送问题，这些药物就有可能主导未来的市场。

结论

调节未用药靶点的各种新兴分子模式作为变革性治疗似乎非常有吸引力。然而，它们也可能给药物发现和开发科学家带来前所未有的挑战。例如，渗透性差、药代动力学差、溶解度差、剂量要求高等问题在新模式中变得越来越普遍。这些挑战将要求制药科学家建立新的能力，开发新技术，和/或寻求替代给药途径，以改进和评估这些bRo5模式。未来的发现/开发团队需要更慎重地整合成药性和成药性评估，并了解它们的相互依赖关系，才能通过这种范式转变取得成功。总之，作者强调了结合成药性和可开发性以影响发现的重要性，以继续使用SAR方法解决每种分子模式的关键问题，这将减少对使能技术的需求和相关成本。

本出版物展示了最近成功的药品，这些产品正在扩大成药领域。然而，这些成功是罕见的，而且要完成令人失望的统计数据，还有更多的失败。随着这些分子变得越来越大和复杂，由于漫长的合成、复杂的制造、专门的配方和严格的储存要求，商品成本也相应上升。从长远来看，开发复杂的bRo5分子是否具有成本效益仍有待确定。作者对不同模式的观察是，高效和卓越的选择性可能是这些具有挑战性的模式未来成功的关键，但有一点非常清楚：它们将需要新的策略、技术和早期、强大的跨学科伙伴关系，以将其转化为患者可及的药物。

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