一篇文章彻底掌握 p-Nrf2/Nrf2 蛋白跑胶技巧

 Nrf2（核因子E2相关因子2）是一个重要的转录因子，在细胞抵抗氧化应激和其他应激反应过程中发挥关键作用。磷酸化是Nrf2激活及调控其功能的关键机制之一。在进行磷酸化Nrf2蛋白的Western blot实验时，尽管操作流程与常规蛋白检测相差无几，但由于磷酸化状态特别容易被降解，因此在处理磷酸化蛋白时需要更加小心和精确，以确保实验的高效进行和结果的准确性。

一、蛋白提取注意事项

1.快、准、冷：由于蛋白磷酸化是一个快速反应，因此提取磷酸化Nrf2蛋白的过程中，需确保操作迅速、样品新鲜且全程在低温环境中进行。例如，在提取细胞蛋白时，应使用预冷至4℃的PBS缓冲液；在提取动物蛋白时，研磨珠和研磨仪也应预冷至4℃。此外，离心管应保持在冰上以维持低温。

2.蛋白酶和磷酸酶抑制剂： 为防止样本中的磷酸化位点被降解，使用包括焦磷酸钠（Na3PO4）、氟化钠（NaF）和亮抑酶肽（Leupeptin）在内的抑制剂。应新鲜配制裂解液，并确保其中含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂，以免条带变浅而影响实验结果的可信度。

3.避免反复冻融： 为保护蛋白质结构的完整性，应避免样本的反复冻融。如需储存样本，建议分装后在-80℃以下保存，以防止蛋白质降解。

4.避免过度机械搅拌： 过度的机械搅拌可能破坏蛋白质的天然结构和磷酸化状态，因此建议采用温和的搅拌方法进行样品处理。

5.使用适当的缓冲液：选择能够稳定磷酸化蛋白的缓冲液，通常含有适量的盐离子（如NaCl），以维持蛋白质的稳定状态，并增强实验的可靠性。

二、检测p-NRF2注意事项

1.制胶

① 玻璃板准备：提前清洗玻璃板，使用双蒸水（dd水）冲洗，并彻底烘干。在封板时，确保支架与底座的胶条紧密契合。固定时，两侧应同时施加均匀的力度旋动齿轮把手，避免用力过大导致玻璃破裂。（注意：封好后可注入dd水进行试漏，确保无泄漏后用滤纸擦净，再灌胶。）

② 分离胶灌注： 配制分离胶后，充分混匀；使用枪头置于两玻璃板间的胶室，沿玻璃板壁缓慢注入。灌满分离胶的2/3后，立即用100%乙醇或纯水覆盖封胶层。根据目的蛋白的分子量选择分离胶浓度，以p-Nrf2（100~110 kDa）为例，推荐使用10%的胶。

③ 胶凝固处理： 胶充分凝固后，倒去胶上层的水或乙醇，并用吸水纸将残留的液体彻底吸干。

④ 浓缩胶制备： 配制5%的浓缩胶并充分混合。将剩余空间灌满浓缩胶，并将梳子入其中。插入梳子时应保持水平，以防止气泡的产生，影响上样效果。

2.电泳

① 拔梳：当凝胶完全凝固后，均匀用力缓慢拔除梳子。如果上样孔出现变形，可用适当粗细的针头轻轻调整，但应小心操作以避免损伤胶的表面。

② 添加电泳液： 倒入新配制的电泳液，确保液面完全覆盖玻璃板。为了确保最佳电泳条件，电泳液应当现配现用。

③ 上样：拔除梳子后，按照之前蛋白定量的体积，将Marker（通常为4 µL）和预先煮沸的蛋白仔细上样于胶孔中。上样时应注意使用移液枪吸一打二，保持缓慢匀速以确保每孔上样量的一致性。

④ 装置检查：在盖紧电泳槽时，确保各边缘紧密吻合以防漏液。漏液可能导致电压不稳定，进一步影响电泳效果，可能导致电泳时间延长，并引发条带变形、位置偏移及条带模糊等问题。

⑤ 电泳运行： 我通常将上层胶条件设定为80V运行40分钟，下层胶为120V运行100分钟。在电压稳定的条件下，此时段足以确保Marker完全分离。当然，当实验时间紧迫时，也可将电泳提前结束，但应确保目标蛋白迁移至胶下缘约1厘米处。

3.转膜

① PVDF膜准备：剪适当大小的PVDF膜，并放入培养中，用无水甲醇浸泡约15秒以进行激活。

② 准备转膜夹： 在托盘倒入适量湿转液，将三明治夹充分浸透。

③ 条带与膜的排列： 根据Marker标记, 将切下的目标蛋白凝胶条带用湿转液浸湿，然后小心地放置在黑色转膜夹上。随后，将已经激活的PVDF膜覆盖在条带上，注意膜和条带的正面对齐，确保无气泡存在，覆盖好三明治夹。牢记：黑对黑（胶）和白（膜）不能错位。

④ 三明治夹装入转印槽：放置三明治夹时，确保黑色对黑色，白色对红色的正确连接顺序。

⑤ 转膜过程： 倒入预冷至4°C的转膜液进入转印槽。注意：在转印槽间隙中可以放置冰袋，整个装置在碎冰环境中进行，以降低转印温度，从而避免条带在高温下变形或蛋白降解。在我的实验中，将p-Nrf2在300毫安（mA）下转膜55分钟，结果条带表现良好！

4.封闭

    在转印完成后，将PVDF膜转移到含有封闭液的培养皿中。建议使用快速封闭液，因为快速封闭液能够缩短封闭时间并提升实验效率。在处理p-Nrf2时，不建议使用牛奶进行封闭，因为牛奶中含有磷酸酶等杂质，可能会干扰磷酸化抗体与靶蛋白的结合，导致背景噪声增高。虽然快速封闭液通常只需封闭15分钟，但为了确保更全面的封闭作用，我通常会延长时间至30分钟，以避免封闭不彻底导致PVDF膜显影时出现不必要的黑色斑点。

5.一抗孵育

  磷酸化抗体的质量对于检测效果至关重要。我使用的是艾比玛特（Abmart）公司的抗体，按1:1000比例进行稀释，结果表现令人满意。当然，在实验中可以根据需要适当调整抗体的稀释倍数，以确保最佳检测效果。

具体步骤：

① 准备抗体孵育盒：使用无菌、无酶的抗体孵育盒进行一抗孵育。

② 配制一抗溶液：按照比例配制一抗，并倒入孵育盒中。对于内参蛋白，使用1:2000的抗体稀释比例；而对于目的蛋白如Abmart抗体的p-Nrf2，则使用1:1000的抗体稀释比例。

③ 孵育：确保PVDF膜完全浸泡在抗体溶液中，并在4°C的摇床上孵育过夜。但应注意孵育时间不可过长，以防止非特异性结合带来的背景干扰。

6.二抗孵育

① 回收一抗：小心回收一抗溶液，以便于未来的实验再利用。

② 洗膜：使用TBST缓冲溶液清洗PVDF膜，共进行3次，每次洗涤时间为5-10分钟，期间使用室温摇床以确保彻底清洗。

③ 配制二抗溶液：将二抗按1:5000的比例稀释在抗体稀释液中，确保二抗溶液均匀且稳定。

④ 二抗孵育：将PVDF膜放置于稀释好的二抗溶液中，在室温下于摇床上孵育2小时以上以充分结合。

7.显影\膜再生

① 回收二抗：小心回收二抗溶液，以便资源节约与再利用。

② 洗膜：使用TBST缓冲液清洗PVDF膜3次，每次洗涤时间为5-10分钟，确保彻底清除未结合的抗体。

③ 制备显影液：按照A液和B液1:1的比例配制显影液，操作时应避光以防止光化学反应干扰。

④ 显影：进行显影处理，通过合理的曝光时间确保信号清晰可辨。

⑤ 再次洗膜：将显影完成后的PVDF膜用TBST清洗3次，每次5-10分钟，以除去显影过程中可能残留的化学物。

⑥ 膜再生：将膜浸泡在膜再生液中，并在室温摇床上孵育15分钟，以去除PVDF膜上的p-Nrf2抗体。

⑦ 重复封闭与孵育：对PVDF膜进行封闭处理，再重复进行Nrf2抗体孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜及显影的步骤。

注意事项

① 普通内参：使用常见内参蛋白（如Actin、GAPDH、H3等）作为体系对照，以确保每个样品的上样量一致，从而消除体系本身的变动对实验结果的影响。这对于数据分析至关重要，能够保障结果的准确性和可靠性。

② 磷酸化蛋白和总蛋白的对照：在检测磷酸化Nrf2时，除了需检测磷酸化形式外，还必须同时检测Nrf2的总蛋白含量。仅凭磷酸化蛋白的表达变化无法充分说明问题，而是需要考察磷酸化蛋白与总蛋白的比值变化，才能确定磷酸化水平的真实变化。

这些注意事项对于确保Western blot实验的精确分析至关重要，通过合理设置对照和检测策略，使得结果能够准确反映蛋白质的生理状态和调控机制。