16S rRNA 基因测序：概念、原理、方法、步骤、应用

一、什么是16S rRNA基因？

核糖体作为蛋白质合成的关键生物结构，由两个亚基组成，每个亚基都包含蛋白质和核糖体RNA（rRNA）。在蛋白质合成过程中，rRNA负责将mRNA（信使RNA）中的遗传信息翻译成氨基酸序列，从而指导蛋白质的合成。

在原核生物中，核糖体由两个亚基构成：较小的30S亚基和较大的50S亚基。这两个亚基共同组成一个完整的70S核糖体。这里的" S "代表的是Svedberg单位，这是用来衡量颗粒在离心过程中沉降速率的物理单位。其中，30S亚基包含16S rRNA和21种不同的蛋白质组分。

16S rRNA基因是一个长约1,500个碱基对（bp）的分子，其结构特征在于保守区域和可变区域的交替分布。这些保守区域在不同微生物中具有高度相似性，这使得它们成为设计通用引物的理想靶点，能够从多种细菌中扩增出16S rRNA基因。而散布在保守区域之间的可变区域则表现出显著的序列多样性，这种多样性为区分不同微生物种类提供了重要依据。

在细菌的识别和分类研究中，这些区域具有特别重要的价值。具体来说：

• 保守区域的相似性使它们成为通用引物设计的基础，能够实现跨物种的广泛扩增；
• 可变区域的多样性则为细菌的鉴定和分类提供了关键信息；
• 16S rRNA基因包含9个高变区（V1至V9），这些区域的序列差异为系统发育分析提供了重要依据。

16S rRNA 基因显示可变和保守区域

二、16S rRNA基因测序原理和方法

1. 基本原理

16S rRNA 基因测序是一种靶向基因组特定区域的扩增子测序技术。其核心原理是利用 16S rRNA 基因中的遗传信息来识别和分类细菌及古细菌物种。由于所有细菌和古细菌都含有高度保守的16S rRNA基因，这一基因被广泛用作识别这些微生物的分子标记物。

2. 技术优势

在分子生物学技术中，16S rRNA具备以下显著优势：

• 普遍性：核糖体RNA和核糖体存在于所有细胞中，确保了检测的普适性。
• 保守性：16S rRNA基因在进化过程中高度保守，使其成为理想的分子标记物。
• 无需培养：该技术不需要对微生物进行培养，适用于研究难以培养的微生物。

3. 分析方法

16S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下三种：

1）测序法

将PCR扩增产物插入质粒载体中进行克隆。对克隆产物进行测序，并将其与16S rRNA数据库中的序列进行比对。通过比对结果确定目标序列在进化树中的位置，从而鉴定样品中的潜在微生物物种。优点是能够提供全面的序列信息；缺点是操作复杂且需要大量测序工作。

2）探针杂交法

在PCR扩增后，利用特异性探针与扩增产物进行杂交。通过检测杂交信号获取微生物组成信息。进一步结合原位杂交技术，可以直接观察微生物的空间分布及其丰度。优点是能够快速获取微生物组成信息；缺点是探针设计和杂交条件要求较高。

3）限制性片段长度多态性（RFLP）分析

对PCR扩增产物进行限制性内切酶切割，分离产生的DNA片段。通过电泳分析片段长度多态性（RFLP）模式。将获得的 RFLP 数据与核糖体文库中的条目进行比较，分析样品中的微生物组成及其相互关系。优点是操作简便且成本较低；缺点是分辨率有限，无法提供详细的序列信息。

16S rRNA 基因检测

三、16S rRNA基因测序技术和步骤

目前，基于 16S rRNA基因的技术主要包括以下几类：

• 聚合酶链反应（PCR）：通过特异性引物扩增目标区域，是最常用的扩增技术。
• 巢式 PCR：通过两轮扩增提高目标序列的特异性和灵敏度。
• 多重半巢式 PCR：在同一反应体系中同时扩增多个目标区域，适用于高通量检测。
• 逆转录 PCR（RT-PCR）：用于扩增 RNA 病毒或其他含 RNA 的微生物的 16S rRNA 基因。
• 寡核苷酸探针技术：通过设计特异性探针与目标序列杂交，实现快速检测和分类。

1. 16S rRNA基因测序涉及的步骤

16S rRNA基因测序涉及以下5个步骤：

rRNA基因测序涉及的步骤

1）样本采集与处理

首先，从感兴趣的环境中收集微生物样本。样本来源包括土壤、水体、肠道微生物组等。根据样本类型的不同，采用相应的采集程序以确保样本的代表性。在采集过程中，必须严格防止污染，并采取适当的措施保存样本。

在分离 DNA 之前，需要对样本进行预处理以去除污染物。这通常包括使用酶、加热或物理方法（如过滤或离心）来去除杂质。预处理步骤的选择取决于样本类型和目标微生物的特性。

2）DNA 提取

完成样本采集后，使用多种化学和物理方法提取微生物 DNA。DNA 提取的关键步骤包括：

• 物理破碎：通过超声波处理或机械研磨破坏细胞壁和细胞膜。
• 化学裂解：使用去污剂和酶（如蛋白酶 K）分解细胞结构。
• 纯化：通过柱层析、磁珠分离或其他方法去除杂质，获得高质量的 DNA。

3. PCR 和文库构建

提取到 DNA 后，进入 PCR 和文库构建阶段：

PCR 扩增：使用聚合酶链反应（PCR）扩增 16S rRNA 基因的目标区域。选择合适的引物和优化 PCR 条件是确保扩增特异性和效率的关键。

文库制备：扩增产物经过片段化处理后，添加接头以制备测序文库。随后通过纯化步骤去除多余的接头和引物，确保文库的质量符合测序要求。

用于16S rRNA高变区的引物序列

4. 高通量测序

构建好的文库通过高通量测序平台进行测序。常用的测序平台包括：

• Sanger 测序：适用于小规模、高精度的测序需求。
• Illumina：高通量测序平台，适合大规模平行测序。
• Ion Torrent：基于半导体芯片的测序技术。
• Oxford Nanopore 和 PacBio：长读长测序技术，适用于复杂基因组的分析。

测序过程中，DNA 文库被扩增并生成数百万个短序列片段。原始序列数据随后经过质量控制和初步分析。

5. 数据分析

测序完成后，进入数据分析阶段。这一阶段通常包括以下步骤：

• 数据预处理：修剪低质量读段并去除宿主或其他非目标序列。
• 聚类分析：将相似的序列聚类到操作分类单元（OTU）中。
• 序列比对：将 OTU 与公共数据库（如 SILVA、Greengenes 或 RDP）中的参考序列进行比对。
• 分类注释：根据比对结果为 OTU 分配分类学身份（如门、纲、目、科、属、种）。
• 统计分析：使用统计方法分析不同样本之间的微生物群落组成和多样性差异。

常用的数据分析工具包括 QIIME、MOTHUR 和 USEARCH-UPARSE 等。这些工具提供了标准化的工作流程和用户友好的界面，便于研究人员快速完成分析。

四、16S rRNA基因测序的应用

• 16S rRNA 基因测序被认为是鉴定细菌种类和分类学分类的标准方法
• 测序技术可用于描述从未在实验室成功培养的新物种
• 可以将细菌重新分类为全新的属或种
• 它在微生物学中的测序是鉴定细菌的表型技术的一种廉价且快速的替代品
• 一种强大的遗传方法，可以识别新的病原体
• 这些基因序列的某些区域呈现用于识别细菌的物种特异性特征序列
• 核苷酸探针用于鉴定序列分析、系统发育分析、临床细菌和细菌分子分类