科研必备：快速判断 qPCR 数据可用性的技巧！

在完成qPCR实验后，评估和确认数据的可靠性是至关重要的一步。即便实验结果的趋势符合最初的假设，如若数据本身不够可靠，任何结论都可能缺乏支撑，不应仅因为其符合预期就轻易被采用，以下是确保数据可靠性的关键方面：

一、第一步Ct值的评估

Ct值（循环阈值是评估qPCR数据质量的重要指标，直接反样本中目标模板的丰度。以下是关于Ct值的标准和建议

1.优秀（Optimal）：

①内参基因的Ct值在14-18之间，表明内参质量良好，稳定且丰度适中。

②目标基因的Ct值在14-18之间，表示丰度高且结果稳定，适合进一步分析。

2.良好（Acceptable）：

①内参基因的Ct值介于12-20之间，适合大多数实验条件。

②目标基因的Ct值在14-32之间，虽然范围稍广，但依然可靠。

3.勉强可用（Marginal）：

①内参基因的Ct值在10-22之间，这可能表明一些变异或噪音，但仍可在一定限度内使用。

②目标基因的Ct值在14-35之间，需谨慎解释，数据仍可使用，但可能存在较大变异。

    如果目标基因的Ct值超过35，尽管数据在技术上是可用的，但结果的准确性可能会受到显著影响，容易产生偏差。这种情况下，建议重新准备样品和进行实验，以确保数据的精度和可重复性。

    保持对Ct值的标准化评估可以提高qPCR结果的可信性，确保所获取数据的生物学解释合理且准确。同时，密切监控正负对照的Ct值也可以帮助识别潜在问题并及时纠正。

二、第二步溶解曲线检查

1.熔点（Tm）：目标产物的熔点应在75-90°C之间，表明特定引物和目标序列的稳定性，并确保扩增产物的特异性。

2.峰型：①理想的溶解曲线应表现为单一清晰的峰，表明单一特异性产物的形成。

②如果出现杂峰，可能指示非特异性扩增或引物二聚体，这需要在实验设计中进行优化和纠正。

3.峰距：在实验设计上，多个扩增反应的峰距（同一类样品）理想情况下应在5个Tm单位内，以确保试剂和反应条件的一致性。

    注意不同反应中熔融温度的均一性可以增强结果对比的精确性和可靠性，通过对溶解曲线的仔细分析，可以确定qPCR反应的特异性和纯度，及时识别并排除任何可能影响结果准确性的因素。（较好溶解曲线是单峰）

（双峰说明引物特异性差要换引物了）

三、第三步扩增曲线观察

尽管扩增曲线在分析中常被忽略，但它同样是验证qPCR实验效果的重要因素。以下是对扩增曲线需要关注的关键点：

1.平台期：扩增曲线应清晰展示出一个稳定的平台期，这表明反应已达饱和，扩增效率稳定。

2.荧光强度：增加的荧光强度（Fluorescence）起码应达3以上，以便识别出足够显著的信号变化，从而确保实验的灵敏度。

3.二次抬头现象：理想的扩增曲线不应出现二次上升，这可能反映非特异性扩增或背景噪音，需要排除这些干扰。

    在大多数情况下，如果Ct值和溶解曲线验证无误，那么可以顺利进入下一个步骤进行更深入的数据分析。然而，为确保数据的准确性和可信度，建议在qPCR完毕后，关注扩增曲线的表现，以捕获可能被忽视的问题。

（图一：好的扩增曲线Ct值合适平台期明显、图二：Ct值很大能否使用要考虑了、

图三：Ct值非常大都扩增失败或者组内差距不小需要重做）