稳定高效的慢病毒转染！

一、慢病毒转染

在我们的实验中，通常需要在细胞中导入质粒，以实现基因过表达（overexpression），敲除（CRISPR）或敲低（knockdown）。质粒导入的方法主要有两种：

①瞬时转染:这种方法所需时间较短，但对于某些难以转染的肿瘤细胞，转染效率较低，并且只能在细胞内维持3-5天，最多约一周。

②稳定转染:对于长期基因表达，实验室最常采用且具高可行性的方法是慢病毒转染（Lentiviral Transduction）。通过慢病毒转染技术，可以将目的基因整合到宿主细胞的基因组中。虽然这种方法所需时间更长且成本稍高，但其具有更高的转染效率。经过筛选后，转染的细胞株可以长期保持目的基因的表达，非常适合需要持续研究的实验。

二、慢病毒载体构建质粒纯化提取

常见质粒系统介绍：

1.病毒包装辅助质粒-1(psPAX2载体)

2.病毒包装辅助质粒-2(pMD2G载体)

3.目的质粒(根据实验需求而定)

①Crispr:IentiCRISPR v2

②shRNA Knock down:pLKO.1-TRC

③Over-expression:pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro

为了构建慢病毒载体，首先需将上述质粒转化至DH5α感受态细胞中进行扩增。成功扩增后的质粒应使用去内毒素质粒提取试剂盒进行进一步提取，以确保质粒纯度，提高后续转染的成功率。提取完毕后，应进行测序验证，确保目的基因的正确性和完整性。

三、293T质粒转染包装病毒

在进行293T细胞质粒转染和病毒包装过程中，选择合适的转染试剂十分重要。市场上提供多种选择，如Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000，虽然效果出色，但价格较高。为实现更具经济效益的转染，我通常采用性价比较高的PolyJet转染试剂，其效果同样令人满意。以下是使用PolyJet进行质粒转染的具体方法：

①细胞准备：在转染前一天，将293T细胞按照适宜密度铺板（以6厘米培养皿为例）。

②调整细胞密度：第二天当293T细胞密度达到约70%-80%时，开始进行质粒转染。在转染前，首先将培养皿中的培养基更换为2.8毫升新鲜的完全培养基。

③制备质粒混合液：将总量为2.5 µg的三种质粒按4:3:1比例混合，即目的质粒: psPAX2 : pMD2G，加入100 µL无血清培养基中，轻轻混匀。

④制备PolyJet混合液：将7.5 µL PolyJet转染试剂加入另一个100 µL无血清培养基中，轻轻混匀。

⑤复合物混合与孵育：将PolyJet混合液加入至质粒混合液中，混匀。然后，在室温下孵育15分钟。

⑥加入细胞进行转染：将上述复合物均匀滴加到6厘米的培养皿中，并轻轻摇晃以确保均匀分布。

⑦更换培养基：经过12-16小时后，将培养基更换为4毫升新鲜的完全培养基，以优化细胞生长环境。

四、病毒收集、纯化与浓缩

在成功进行质粒转染后，需要收集和纯化产生的病毒以用于后续实验。以下是标准的病毒收集和处理步骤：

①病毒上清收集：在转染后的48小时和72小时，分别收集培养上清液。通常情况下，48小时的病毒上清一般已经足够满足后续实验的需求，可以选择只收集此时间点的上清液。

②过滤去除杂质：使用0.45 µm滤膜对收集的上清液进行过滤，以去除细胞残留和其它杂质，从而获得病毒粗液。此步骤确保去除不需要的细胞碎片，仅留下含病毒的纯净液体。

③病毒浓缩：为了进一步增加病毒浓度，可以使用100 kDa的超滤管进行离心浓缩。设置离心机为3000 rpm，并运行20分钟，以获得浓缩的病毒液体。这一过程将进一步提升病毒效价，为后续实验使用做好准备。

④病毒储存：将获得的病毒粗液或浓缩液按需分装，并储存在-80°C的冷冻环境下，以确保病毒的稳定性和活性。在储存过程中，务必避免反复冻融，以防止病毒效能下降。

五、病毒感染目标细胞与稳定细胞株的筛选

①提前一天细胞铺板：在转染前一天，将目标细胞（如肿瘤细胞）均匀铺板于6厘米的培养皿中，以确保细胞状态良好，为转染做好准备。

②转染细胞密度调整：第二天当细胞密度达到80%左右时，进行病毒转染。这一密度通常有利于高效的病毒感染，同时预防过度接触抑制。

③病毒接种：向培养皿中的目标细胞添加数百微升的病毒粗液或几微升浓缩病毒液。同时，添加10 µg/ml的Polybrene，这是一种慢病毒感染增强试剂，能显著提高感染效率。

④换液：转染24小时后，将培养基更换为新鲜的完全培养基，以改善细胞生长环境并去除残留病毒颗粒。

⑤抗生素筛选：继续孵育24小时后，使用抗生素进行筛选。若目的质粒载体含有嘌呤霉素抗性基因，则可添加1-2 µg/ml的嘌呤霉素进行筛选。经过约48小时的筛选后，对照组（野生型WT细胞）通常会大量死亡，而成功感染并稳定表达目的质粒的细胞株将存活下来，形成稳转细胞株。

六、稳转株的验证

根据不同的实验目的,验证稳转株例如:

①对于过表达或敲除某蛋白的情况，可以通过Western Blot技术来验证目的蛋白的表达情况。

②当需要敲低某基因时，可以使用qPCR技术进行验证。成功构建稳转株后，就可以用于进行后续的实验研究。

七、注意事项

①293T细胞传代限制：用于包装病毒的293T细胞不宜进行过多次的传代。一般情况下，在复苏后传代2-3次为最佳选择，以保证细胞的活力和感染效率。

②质粒转染方法：由于不同转染试剂可能会有不同的应用细节，务必根据所使用转染试剂的说明书进行操作，来保证最佳的转染效率和细胞状态。

③病毒过滤注意：不建议使用0.22 µm滤膜进行病毒过滤，因为这样会降低病毒的滴度，影响后续感染效率，建议使用0.45 µm滤膜。

④细胞密度控制：在病毒感染实验中，肿瘤细胞的密度不宜过低，以免影响感染效率。保持适当的细胞密度有助于实现更均匀的病毒感染。

⑤病毒量调节：应调节病毒的感染剂量，做到适可而止。过多的病毒量可能会显著影响细胞状态乃至细胞形态改变，进而干扰实验结果的准确性。