顶刊精读 | Cell | Xp11易位肾细胞癌性别差异的遗传基础

Basic Information

• 英文标题： A genetic basis for sex differences in Xp11 translocation renal cell carcinoma
• 中文标题：Xp11易位肾细胞癌性别差异的遗传基础
• 发表日期：NA
• 文章类型：Article
• 所属期刊：Cell
• 文章作者：Mingkee Achom | Srinivas R. Viswanathan
• 文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424008328

Highlights

Para_01

1. TFE3驱动融合通常通过Xp11 tRCC中的相互、平衡重排产生
2. tRCC的女性性别偏倚由活跃和非活跃X染色体的重排解释
3. 活跃与非活跃X染色体重排施加性别特异性进化约束
4. 非活跃X染色体与常染色体易位与X染色体再激活和/或常染色体沉默相关

Summary

Para_01

1. Xp11易位肾细胞癌（tRCC）是一种罕见的、女性为主的癌症，由Xp11.2染色体上的转录因子结合到IGHM增强子3（TFE3）基因与X染色体（chrX）或常染色体上的伴侣基因融合所驱动。
2. 目前尚不清楚哪些类型的重排导致了TFE3融合，融合是否可以来自活性X染色体（chrXa）和非活性X染色体（chrXi），以及chrXi易位产生的TFE3融合是否解释了tRCC的女性为主的特征。
3. 为了解决这些问题，我们对tRCC全基因组中的chrX重排进行了单倍型特异性分析。
4. 我们显示，TFE3融合普遍以相互易位的形式出现，并且致瘤性TFE3融合可以来自chrXi：常染色体易位。
5. 女性特有的chrXi：常染色体易位导致涉及常染色体伴侣基因的TFE3融合呈现2:1的女性对男性比例，并解释了tRCC的女性为主的特征。
6. 我们的结果突出了X染色体遗传学如何限制体细胞chrX改变，并构成了癌症性别差异的基础。

Graphical abstract

Keywords

• cancer sex bias; cancer genomics; X inactivation; X chromosome; XIST; gene fusions; kidney cancer; renal cell carcinoma; translocation renal cell carcinoma; tRCC; TFE3; MITF

Introduction

Para_01

1. Xp11易位肾细胞癌（tRCC）是一种侵袭性强、女性为主的肾癌亚型，目前尚无有效治疗方法。
2. tRCC的定义是由X染色体短臂（chrX）上的转录因子结合到IGHM增强子3（TFE3）基因与chrX或常染色体上的若干反复出现的伴侣基因之间的致癌融合所决定的。
3. 除了驱动融合外，tRCCs还含有少量其他遗传变异。

Para_02

1. tRCC的一个引人注目的临床特征是，它表现出强烈的女性优势，这与肾癌其他亚型中的男性优势形成鲜明对比。
2. 由于TFE3位于X染色体上，一个悬而未决的问题是，tRCC发病率中的女性性别偏倚是否可以解释为女性能够从两条X染色体同源染色体中产生致癌的TFE3融合，而男性只能从一条X染色体同源染色体中产生。

Para_03

1. 在女性中，两条chrX同源染色体由于X染色体失活（XCI）而具有不同的表观遗传和转录状态。
2. XCI发生在早期胚胎发育过程中，并实现男性和女性之间chrX基因表达的剂量补偿。
3. 虽然任一chrX同源染色体都可以被标记为XCI，一旦确立，活性X染色体（chrXa）和非活性X染色体（chrXi）在后代细胞中稳定遗传。
4. 对于通过克隆扩张产生的癌细胞，祖先肿瘤细胞中的chrXa和chrXi身份因此在所有子细胞中得以保留。

Para_04

1. chrX（与常染色体相对）的一个显著特征是，大多数chrX转录发生在chrXa同源染色体上（除了少数逃逸基因以双等位基因形式表达）。
2. 因此，包含chrXa上必需基因的大片段缺失是不可容忍的。
3. 然而，在女性细胞中，chrXi上相同区域的缺失可能是可以容忍的。
4. 因此，探究女性中单倍型特异的体细胞chrX缺失，提供了一种推断癌细胞中chrXi和chrXa身份的策略。

Para_05

1. 在这项研究中，我们利用tRCC作为一种典型的性别偏倚癌症，由chrX上的致癌基因驱动，来探究chrX遗传学对癌症性别差异的尚未充分探索的影响。
2. 我们提供了确凿的证据，表明致癌的TFE3融合可以由chrXi和常染色体之间的易位产生，并阐明了它们的转录后果，包括XCI的部分逆转和相邻常染色体区域的沉默。

Results

Landscape of genomic alterations in tRCC from WGS

全基因组测序（WGS）揭示的tRCC基因变异景观

Para_01

1. 我们对15名患有tRCC的个体（5名男性和10名女性）的肿瘤和匹配的种系DNA进行了全基因组测序（WGS）。
2. 11个样本来自未经治疗的患者，18个样本在患者接受tRCC系统性治疗后收集（总计29个肿瘤样本）。
3. 对部分有可用材料的样本进行了批量RNA测序（RNA-seq）。
4. 在一名患者（TRCC18）中，在开始使用酪氨酸激酶抑制剂（卡博替尼）和免疫疗法（纳武单抗）的系统性治疗前收集了原发肿瘤组织，并在尸检时收集了13个转移灶。
5. 在这种情况下，对原发肿瘤进行了批量RNA测序和单核RNA测序（sNuc-seq），并在肝转移灶上额外进行了批量RNA测序（图1A和1B；表S1）。

• 图1. tRCC队列中TFE3融合的概述 (A) 研究设计。 (B) tRCC队列的总结（见表S1）。 (C和D) TFE3融合伴侣（C）和tRCC队列中TFE3基因座的断点（D）。每个融合（C中的一个弧线）和断点（D中的垂直线）按性别着色。 (E和F) 左图：整合基因组学查看器（IGV）的RNA-seq读数快照，显示TRCC8中ASPSCR1（外显子1-7）和TFE3（外显子6-10）之间的致癌融合（E）以及TRCC18中SFPQ（外显子1-6）和TFE3（外显子2-10）之间的致癌融合（F）；右图：融合转录本和融合基因序列的示意图。另见图S1和S2。

Para_01

1. 我们进行了体细胞单核苷酸变异（sSNVs）、插入缺失（indels）和重排的变异发现。
2. 此外，我们采用了我们之前描述的用于单倍型特异性拷贝数分析的方法。
3. 对于来自TRCC18的肿瘤，我们基于sSNV和单倍型特异性拷贝数改变（STAR方法）的联合分析重建了系统发育树。
4. sSNV的平均负担为每兆碱基0.88（范围0.28–2.7，排除了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，因为FFPE DNA文库中伪迹的高频出现）。
5. 在tRCC中观察到的SNV负担低于透明细胞肾细胞癌，但与尤文肉瘤相当，后者是另一种易位驱动的实体瘤，其中位sSNV负担小于每兆碱基1。
6. 值得注意的是，两个样本（均来自同一个体：RCC16），最初被诊断为tRCC，随后基于未检测到TFE3融合但存在标志性的ccRCC改变（包括chr3p丢失和失活的VHL突变）被推断为误分类的透明细胞RCC（ccRCC）；这两个样本的sSNV负担也显著高于tRCC。

• 图 S1. 通过全基因组测序（WGS）揭示的tRCCs中的复发突变和拷贝数改变，与图1相关
• （A）tRCC WGS队列中癌症基因普查（CGC）中1级癌症基因的复发单核苷酸替换和插入/缺失突变
• 仅包括在至少一个样本中预测具有高功能影响的癌症基因，或在两个或更多样本中具有高/中等影响的癌症基因
• 由于FFPE文库中伪迹的普遍存在以及一些FFPE样本（例如，TRCC3/4）中肿瘤细胞克隆分数较低，FFPE样本（TRCC3/4/7/9/15）在突变频率计算中被排除（NA）
• 但为了提供信息，列出了CGC基因的潜在致病突变
• 我们使用拷贝数改变和点突变来评估肿瘤细胞的克隆分数（纯度）
• 对于TRCC3和TRCC9，由于缺乏大拷贝数改变以及FFPE DNA中点突变检测的不确定性，未评估纯度
• （B）100 kb区间内全基因组拷贝数增加（红色）和丢失（蓝色）的分布
• 已知癌症驱动基因在峰/谷区域被注释；两个插图突出了chr1p（跨越CDKN2C, ARID1A）和9p（跨越CDKN2A/2B）上的复发局灶性缺失
• （C）9例同时进行DNA和RNA测序的TFE3融合的图示视图（表S2）
• 在每个样本中，通过RNA-seq检测到的致癌融合转录本（Partner-TFE3）中包含的外显子在TFE3基因（顶部，融合转录本的3′端）及其伴侣（底部，融合转录本的5′端）的灰色阴影框中突出显示
• 当检测到时，包含在反向融合（TFE3-Partner）中的外显子用虚线框标出（TFE3的5′端和伴侣的3′端）
• TFE3是反义的
• 左侧有阴影框的融合伴侣是正义的，右侧有阴影框的是反义的
• DNA断裂点用带有深蓝色棒棒糖的垂直线表示
• 注意，对于SFPQ，基于RNA-seq数据使用的是isoform NR_136703.1

• 图 S2. 通过全基因组测序（WGS）揭示的tRCC基因组复杂性和进化，与图1相关（A）CIRCOS图显示了等位基因特异性的DNA拷贝数（红色和蓝色分别代表每个亲本等位基因）、染色体间的易位（紫色弧线）以及长距离的染色体内部重排（绿色弧线，断点距离大于1Mb）。对于TRCC18（框出），展示了原发肿瘤样本，包括所有染色体上的等位基因特异性DNA拷贝数（顶部CIRCOS）或显示片段拷贝数改变的选定染色体（底部CIRCOS）；重排在后者的CIRCOS图上标出。TRCC18的其他代表性转移灶分别显示在图4、5、S5和S6中。在RCC16受试者的原发肿瘤和切除的转移灶中，未检测到TFE3融合，提示可能存在误分类（以原发肿瘤的CIRCOS图作为代表）。该基因组的以下拷贝数变化/重排与透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的特征一致：（1）3p缺失的存在是ccRCC的标志性特征；此外，3p缺失与1p末端的缺失伴随染色质碎裂相关，这是ccRCC中常见的重排模式。（2）chr4、8、10、11、15和17上断点的聚集，靠近大片段SCNA的边界，与由多染色体桥断裂产生的重排结果一致，包括区域性染色质碎裂和多个串联短插入的连接。（3）根据等位基因深度分布显示的四个等间距的不同峰，推断肿瘤基因组为4N，表明等位基因拷贝数状态为0、1、2和3；此外，许多片段SCNA处于奇数拷贝数状态，提示在祖先全基因组复制后的下游SCNA进化。早期WGD后继以下游进化的序列与通常为2N或WGD前后变化较少的tRCC基因组形成对比（见图4和5）。
• （B）TRCC12治疗前后的样本中chr5和chr6的等位基因特异性覆盖。整数拷贝数状态由两个样本共享的chr3q和chr17p的截断缺失确定。chr5和chr6的等位基因DNA拷贝数表明，治疗后克隆中B等位基因的6q克隆缺失（6Bq）和A等位基因的5q复制（5Aq），但在治疗前克隆中，两种等位基因的6q亚克隆缺失和5q增益。一种可能的解释是，治疗前肿瘤有两个亚克隆群体：一个包含额外的5Aq拷贝但缺失6Bq，另一个包含额外的5Bq拷贝但缺失6Aq，而治疗后肿瘤仅由前者组成。有趣的是，这两个亚克隆都具有双体的6p、单体的6q和三体的5q（来自两个同源染色体），这与所有tRCCs中这些臂的平均DNA拷贝数相匹配（图S1B）。

Para_01

1. 我们在队列中观察到体细胞拷贝数变异（SCNAs）的负担存在广泛差异（图S2）。
2. 虽然有几个样本在多个染色体上显示出普遍的节段性SCNAs（例如，TRCC8，TRCC10，TRCC15），但也有几个样本没有SCNAs（TRCC3，TRCC11，TRCC17；值得注意的是，这三个都是未经治疗的原发性肿瘤）或仅有臂级变异（TRCC9）（图S2）。
3. 这些观察结果表明，TFE3融合足以诱导tRCC的发展，这与动物模型一致。
4. 这也表明，尽管一些tRCC样本可能在基因组上不稳定，但基因组不稳定性并非癌症进展所必需，与其他癌症相反。
5. 与这一观点一致的是，我们也没有在TRCC12的术后样本中或在与配对的术前标本相比的TRCC18转移灶中识别出明确驱动治疗耐药的突变（图S2；表S3）。

Para_02

1. 我们WGS队列的规模限制了识别tRCC中除TFE3融合外反复中断的癌症基因的能力。
2. 我们评估了经典癌症基因（COSMIC癌症基因普查的1级组）和之前报道在tRCC中反复改变的基因的致病突变发生率。
3. 最常见的改变是CDKN2A的缺失（6/15患者），包括4/15例（26%）中的同源CDKN2A缺失，这与我们在tRCC先前研究中的发现一致。
4. 我们进一步在两个样本中鉴定出CDKN2C和KMT2C的突变，其中至少有一个突变预测具有高致病性影响。
5. 虽然这些基因尚未被报道在tRCC中发生突变，但它们可能对tRCC的发病机制有贡献：CDKN2A/2C的失活可能在功能上相似，且反复的CDKN2C突变已在胶质母细胞瘤中被报道。
6. KMT2D突变先前已在tRCC中被鉴定，KMT2C突变可能在功能上相似。
7. 最后，一个样本（TRCC15）显示出ATM的双等位基因失活，这种突变先前也已在少数tRCC中被报道。

TFE3 fusions universally arise by reciprocal translocations

TFE3 融合普遍通过相互易位产生

Para_01

1. 我们从全基因组测序数据（表S2）中鉴定了TFE3融合断点，并在可用的情况下通过RNA-seq数据进行了验证（STAR方法；图S1C）。
2. 在15名患者中有7个不同的伴侣（图1C），包括2个在X染色体上和5个在常染色体上，所有这些均已有报道。8,12,13
3. TFE3中的DNA断点最常见于外显子4和外显子6之间，这将导致融合蛋白保留TFE3的二聚化和DNA结合域。
4. 然而，在两个病例（TRCC9和TRCC18）中，DNA断点位于第一个外显子上游（图1D）。
5. 对TRCC18的RNA-seq数据分析表明，表达的融合转录本从TFE3的外显子2开始，由于缺乏剪接接受位点而跳过了外显子1；在融合伴侣SFPQ中，DNA断点位于外显子7，并且该外显子在融合产物中也被跳过（图1E、1F和S1C）；在其他癌症中也有类似的跳过外显子事件报道。32,33
6. 通过查询其他已发表的tRCC RNA-seq数据，我们发现了几个TFE3融合的额外实例，这些融合从TFE3的外显子2开始，12 可能是由TFE3上游的断点转位引起的。
7. 在三个病例（TRCC11、TRCC12和TRCC14）中，TFE3基因中的DNA断点位于外显子上，但伴侣基因中的断点位于内含子上。
8. RNA-seq数据的分析显示，在TRCC12中，融合转录本跳过了包含DNA断点的外显子（外显子4）。
9. 在TRCC11中，融合转录本显示了一个框内剪接，剪接接受位点（AG）位于外显子3内，距离DNA断点下游6个碱基（图S1C）。
10. 在TRCC14中也观察到了类似的结果，断点位于TFE3的外显子3。
11. 总的来说，这些观察结果突显了剪接和DNA重排之间的复杂相互作用如何驱动tRCC中融合基因的表达。

Para_02

1. TFE3融合通过四种不同的重排机制产生，所有这些机制都是相互的（图2A和2B）：（1）Xp染色体的旁着丝粒倒位（2例）；（2）X染色体的近着丝粒倒位（1例）；（3）X染色体与常染色体的相互易位（11例）；以及（4）染色质融合（1例）。
2. 值得注意的是，TRCC15中的染色质融合事件涉及chr1、chrX和映射到chr14_GL00019v1_random的核糖体重复序列的相互断裂点，该序列可能位于任何近端着丝粒染色体的短臂上（chr13、chr14、chr15、chr21或chr22）。
3. 这个案例还包含多个其他可能与ATM失活相关的相互易位。
4. 与其他癌症中的致癌融合相比，没有TFE3融合来自复杂/不平衡的重排。
5. 此外，X染色体或其配对染色体的拷贝数改变也很少见。
6. 一个显著的例外是TRCC18，我们在一组转移样本的配对染色体（chr1p）上检测到复杂的SCNAs；这些改变在其他转移性病变或原发肿瘤中的缺失表明，TFE3融合仍然是通过一个简单的相互易位在共同祖先中产生的。

• 图2. 全基因组测序（WGS）揭示的TFE3融合的病因学
• （A）TRCC14（LUC7L3-TFE3融合）中chrX和chr17之间的DNA拷贝数平衡
• 融合伴侣的位置由垂直线标记，并通过相互易位（红色弧线）连接，等位基因平衡由黑色和灰色点完全重叠表示，分别对应等位基因A和等位基因B的拷贝数
• （B）导致TFE3融合的重组类型：（左）chrX内倒位：近着丝粒（chrXp臂内倒位）和远着丝粒（跨越着丝粒的倒位）
• （中）染色体间易位。chrX与常染色体易位，伴侣位于常染色体p臂（例如，SFPQ）或q臂（例如，PRCC）；（右）染色质重组，即三对或更多断裂末端之间的平衡易位（见表S2）
• （C）由TRCC7中的TFE3-RBM10融合说明的TFE3和伴侣位点的非同源末端连接序列特征
• 左：每个伴侣位点的最小DNA丢失或获得（TFE3断裂点无DNA丢失或获得，RBM10断裂点有3 bp缺失）
• 右：重排连接处的最小同源性或插入（RBM10-TFE3连接处有2 bp微同源性，TFE3-RBM10连接处有3 bp插入）
• （D）tRCC WGS队列中TFE3和融合伴侣位点的DNA丢失/获得及连接同源性总结
• x轴和y轴表示TFE3（y）和TFE3易位伴侣（x）断裂点处核苷酸的复制（+）或删除（−）数量
• 每个方形的右上和左下三角形显示相互连接处（伴侣-TFE3或TFE3-伴侣）的微同源性或插入分类
• （E）由双链断裂产生的相对断裂末端之间无变化（i）、删除（ii）或复制（iii）的机制
• （F）显示TFE3和伴侣断裂点连接处（包括相互连接）微同源性（左）或插入（右）长度的直方图
• 在TRCC10中检测到的TFE3-MED15连接处有24 bp插入的异常值是唯一一个在TFE3（27 bp）和伴侣（MED15，6 bp）均有显著删除的实例，可能表明微同源性介导的末端连接。另见图S3

Para_02

1. 总之，我们全基因组测序队列的DNA拷贝数和重排数据表明，TFE3融合普遍通过相互易位产生。

TFE3 fusion junctions are consistent with canonical NHEJ

TFE3 融合连接点与典型的非同源末端连接一致

Para_01

1. 在TFE3融合事件中保留的两种相互易位使我们能够直接分析TFE3基因座和伴侣基因座上的断裂点和连接同源性（图2C）。
2. 我们观察到在TFE3基因座和伴侣基因座上，包括在染色质重组（TRCC15）的所有三个基因座上，DNA的缺失或重复非常少。
3. 在31对相互断裂点（TRCC15中有3对，其他14个案例中各有2对）中，22对的缺失或重复不超过10个碱基对；最大的缺失为71个碱基对（TRCC8中的ASPSCR1），最大的重复为38个碱基对（TRCC12中的PRCC）。
4. 相互断裂点之间没有显著的缺失或重复（图2D）表明，它们源自于钝端或接近钝端的DNA末端（图2E）。

Para_02

1. 钝性DNA末端通常通过经典非同源末端连接（c-NHEJ）进行修复。
2. 与这一预测一致，26/31（84%）的连接点显示出≤2 bp的微同源性或插入（图2F），这与c-NHEJ预期相符，但不符合替代末端连接（a-EJ）或单链退火（SSA）。
3. 互反断点之间序列变化的缺失以及重排连接点处序列同源性的缺失，与之前通过核酸酶实验生成的易位的观察结果一致。
4. 为进一步证明TFE3融合源于双链断裂（DSBs）的c-NHEJ，我们使用CRISPR-Cas9在293T人胚胎肾细胞（STAR方法；表S4）中生成TFE3和PRCC（位于chr1q上的一个反复出现的TFE3融合伴侣）的DSBs。
5. 对结果融合中DNA断点附近的扩增子进行测序，揭示了小插入和缺失的紧密分布（中位indel大小：PRCC-TFE3：3 bp，TFE3-PRCC：3.5 bp），这与原发性tRCCs中的观察结果一致。
6. 原发性tRCCs和实验工程融合中TFE3融合几乎相同的序列特征共同支持TFE3融合源于近钝性DSBs的c-NHEJ（图S3）。

• 图S3. 293T细胞中TFE3融合的CRISPR-Cas9工程，与图2相关 (A) 用于通过CRISPR-Cas9工程PRCC-TFE3融合的sgRNA的基因组位置和用于检测PRCC-TFE3和TFE3-PRCC融合的PCR引物。
• (B) DNA凝胶显示293T细胞编辑群体中的PRCC-TFE3融合。
• (C) 每个PCR扩增子中删除或插入核苷酸数量的分布，相对于从群体中推断的主要PRCC-TFE3断裂点（chr1:156777745和chrX:49038604）。
• (D) DNA凝胶显示编辑群体中的TFE3-PRCC融合。
• (E) 每个PCR扩增子中删除或插入核苷酸数量的分布，相对于主要TFE3-PRCC断裂点（chrX:49038605; chr1:156777746）。两个含有Cas9 DNA序列插入（约75 bp）的扩增子被排除。
• (F) 通过RT-qPCR在编辑群体中检测到的表达的PRCC-TFE3融合转录本，跨越预测的RNA融合断裂点。
• (G) Sanger测序轨迹确认PRCC-TFE3融合连接点。

Para_02

1. 总之，TFE3融合代表了从DSBs和c-NHEJ的经典相互易位模型，我们的结果表明相同的机制也存在于染色质重排中。

Deletions of chrX upon translocation implicate a chrXi origin for TFE3 fusions

染色体X在易位过程中的缺失表明TFE3融合起源于染色体Xi

Para_01

1. 普遍生成的互惠TFE3融合引发了一个问题，即是否两种融合（Partner-TFE3和TFE3-Partner）都是致癌所必需的。
2. 这一观点被TRCC9和TRCC18中der(X)易位（编码TFE3-Partner融合）的亚克隆缺失观察所不支持（注：衍生染色体是根据保留的着丝粒命名的，参见图2B）。
3. 此外，在这两种情况下，断点都位于TFE3基因主体的上游，因此互惠融合基因不包含TFE3的编码序列（图1D）。

Para_02

1. 另一种可能性是，保留这两种易位染色体的原因并非由于对这两种融合的正向选择，而是由于对chrX缺失的负向选择。
2. 对于只有一条chrX的男性来说，任何一种易位染色体的缺失都是不可容忍的，因为这会导致chrX上必需基因的缺失。
3. 在具有一条活性chrX和一条非活性chrX的女性中，如果易位起源于chrXa，则同样存在对缺失的约束。
4. 相比之下，涉及chrXi的易位缺失可能是可以容忍的，因为chrXi上的大多数基因并未活跃转录。
5. 然而，为了使致癌的TFE3融合从chrXi易位中产生，chrXi上的TFE3基因必须与一个具有活性启动子的常染色体上的伴侣基因融合。
6. 因此，chrXi和chrXa的不同表观遗传状态对易位伴侣和TFE3易位的拷贝数状态施加了不同的约束（见图3A）。

• 图3. 染色体X与常染色体易位中的女性优势是tRCC性别偏倚的基础（A）导致TFE3融合的每类染色体X重排的性别特异性约束。（B）来自11项独立研究的tRCC队列汇总。右侧，汇总队列中tRCC病例的性别分布（N = 203）。
• （C）导致致癌性TFE3融合的染色体X:常染色体易位和染色体X内倒位的性别差异：染色体X:常染色体易位显示2:1的女性对男性比例，而染色体X内倒位在男性中富集。男性中染色体X内倒位的富集主要归因于RBM10-TFE3融合，这可能与男性中RBM10的高突变频率有关。
• （D）按性别和重排类型分解的染色体X和TFE3融合伴侣染色体的拷贝数不平衡景观。由染色体X上的缺失（蓝色）引起的拷贝数不平衡仅见于女性。其他类型的拷贝数不平衡（绿色），包括染色体X的增益和伴侣染色体的增益/缺失，在女性和男性中均可见。见图S4。
• （E）由于易位染色体der(X)t(1;X)缺失导致拷贝数不平衡的示例，该染色体包含互惠TFE3融合。此示例为之前研究中通过全外显子测序分析的tRCC样本。显示的是肿瘤DNA的次要等位基因分数（顶部）和标准化拷贝比（底部）。删除区域中的数据点为橙色。另见图S4。

Para_02

1. 通过对TFE3融合和易位染色体拷贝数的系统分析，我们试图验证一个假设，即某些TFE3融合可能起源于chrXi，从而为tRCC女性占优势提供遗传学解释。
2. 我们汇集了来自11项不同研究的203例tRCC病例（图3B；表S5；STAR方法），包括本研究的15例和最初被误分类为其他类型肾癌的35例。
3. 这一队列是目前为止最大的，显示出大约3:2的女性对男性比例（61.1%女性[N=124]; 38.9%男性[N=79]）（图3B）。
4. 然后，我们将与chrX上的伴侣相关的TFE3融合与与常染色体伴侣相关的TFE3融合分开。
5. 这揭示了一个近乎完美的2:1比例（103名女性，50名男性）在chrX:常染色体融合中，相比之下，在由chrX倒位产生的TFE3融合中男性占优势（21名男性，8名女性）（图3C）。
6. 在排除涉及RBM10的融合后，这些融合之前已被报道在突变频率上显示男性偏倚，结果显示chrX倒位没有显著的性别偏倚（11名男性，7名女性；通过二项式检验p=0.24）。
7. chrX倒位融合中不存在性别偏倚与预期一致，即由chrXi倒位产生的融合将保持转录沉默，因此不具有功能性。
8. 相比之下，chrX:常染色体易位的2:1女性对男性比例，为chrXa和chrXi易位共同促进女性中致癌TFE3融合提供了强有力的论据。

Para_03

1. 为了验证TFE3融合基因起源于chrXi时可以容忍编码非致癌融合转录本（TFE3-Partner）的易位染色体拷贝数丢失的假设，我们分析了160例全外显子测序（WES）或全基因组测序（WGS）的DNA拷贝数，使用了一个标准化的工作流程（STAR方法）。
2. 尽管绝大多数TFE3易位在chrX和伴侣染色体上都没有拷贝数改变或失衡，但在141例女性病例中有6例发现了跨越断裂点的删除，这些病例的TFE3融合基因是不平衡的（图3D中的"不平衡伴删除"；图3E展示了其中一个例子）。
3. 我们还发现了11例由于非chrX删除的拷贝数失衡情况（图S4），包括易位染色体的拷贝数增加（图S4A和S4B）或伴侣常染色体上的拷贝数丢失，而chrX上没有拷贝数丢失（图S4D）。
4. 后一种情况可能反映了由染色质交换产生的一个或多个易位染色体上的丢失。

• 图 S4. tRCC 中 TFE3 易位的拷贝数不平衡，与图 3 相关
• （A）来自一个肿瘤（TCGA BP-4756，女性）的全基因组测序数据中的次等位基因分数（顶部）和标准化读深（肿瘤：正常），显示含有致癌 SFPQ-TFE3 融合的易位染色体 der(1)t(1;X) 的拷贝数增加
• chr1（顶部）和 chrX（底部）中拷贝数不平衡的区域用橙色高亮显示
• （B）一个 tRCC 肿瘤（TCGA BQ-5887，男性），显示 der(X)t(1;X) 的拷贝数增加，伴有互易 TFE3-PRCC 融合
• 图表与 A 类似
• 下方显示了重复染色体片段的示意图
• （C-E）三个带有 SFPQ-TFE3 融合的 tRCC 显示
• （C）互易易位 der(X)t(1;X) 中两个片段的缺失
• （D）SFPQ 末端片段的缺失
• （E）致癌易位 der(1)t(1;X) 中两个片段的重复
• 请注意，从未观察到 TFE3 融合的缺失
• 每个样本显示的是次等位基因分数、标准化读深以及 chrX 和伴侣染色体（chr1）的分割等位拷贝数
• 在所有情况下，DNA 拷贝数均由 TITAN 计算，94 该方法不进行局部单倍型推断
• 对于在其中一个断点（SFPQ）存在拷贝数不平衡而在另一个断点（TFE3）不存在的情况，如（D）所示，一个合理的解释是 TFE3 融合起源于染色质重组（多向平衡易位），如图 1B（TRCC15）所示，且拷贝数不平衡反映了其中一个易位染色体的丢失；直接验证这一解释需要全基因组测序

Para_03

1. 总的来说，性别差异在常染色体：TFE3融合的发生率以及与TFE3易位相关的性别特异性拷贝数改变模式表明，致癌的TFE3融合可能来源于女性的chrXa和chrXi。这为tRCC在女性中的优势提供了遗传基础。

Paired genomic and transcriptomic analyses establish chrXi involvement in TFE3 fusions

配对基因组学和转录组学分析确立chrXi在TFE3融合中的参与

Para_01

1. 我们接下来将注意力转向TRCC18，在多个转移性病变中观察到次级拷贝数丢失，这些丢失位于chr1p末端的端粒区域，靠近易位伴侣（SFPQ）。
2. 我们基于单核苷酸变异（sSNVs）推断转移性病变的系统发育树，并使用拷贝数变异（图4；表S6；STAR方法）进行精细的系统发育推断。
3. 在考虑DNA删除后，将单核苷酸变异（sSNVs）分配到系统发育分支（图4B和4C；图S5；图S6；表S6）。
4. 基于单核苷酸变异（sSNV）推导的系统发育树证实了起始事件（即致癌TFE3融合）和后续事件（即全基因组复制和TFE3易位的删除）的时间顺序。

• 图4. 多区域测序揭示的tRCC演变 (A) 来自TRCC18受试者的14个tRCC样本的治疗历史和解剖部位。 (B) 概述了在所有肿瘤中检测到的截断性（左）、共享（中）和私有（右）点突变。每个样本中突变的存在/缺失是通过从截断突变估计的突变等位基因频率（MAF）截止值确定的。更多细节请参见STAR方法和图S5。 (C) 根据共享突变（B）推断的转移性病变的系统发育树。两个推断为近四倍体基因组的样本（肝-4和MedLN）被下划线标出。每个突变根据从恒定假阳性率（0.01）和样本特异性假阴性率（如图S5所述估计）计算的最大似然值分配到分支（a–k），最终的突变负担显示在右侧。请注意，分配到分支b的三组突变（B）几乎全部是由于肺转移和RPLN-2中der(X)t(1;X)下游缺失引起的；这些丢失的突变是祖先突变。在MedLN/肝-4、肺和RPLN-2/RPLN-3样本中删除的chr4、chr11和chr22上也发现了类似的突变模式。有关考虑DNA删除和丢失的突变分配的详细信息，请见表S6。也请参见图S5和S6。

• 图S5. TRCC18转移灶的克隆性分析和体细胞突变的分相，与图4和图5相关
• （A）确定每个肿瘤样本中克隆突变的变异等位基因频率（VAF）阈值
• VAF截止值首先通过k-means聚类确定，以区分亚克隆突变（低VAF）和克隆突变（高VAF），然后使用截断突变（定义为在9个或更多肿瘤样本中通过最小VAF截止值的突变）进行验证
• 未达到VAF截止值的截断突变（按定义属于克隆突变）的百分比决定了假阴性检测率
• （B）直方图显示在特定数量的肿瘤样本中通过最小VAF截止值的体细胞突变数量
• 我们操作性地选择在9个或更多样本中存在的突变作为截断突变；这一阈值并不会实质性影响系统发育推断的结果，因为大多数截断突变在几乎所有（13或14）样本中都通过了截止值，无论是考虑所有突变还是仅考虑二倍体染色体上的突变（这些染色体上没有因二次缺失而丢失的截断突变）
• （C）基于在chr2上识别的截断突变验证每个肿瘤样本的VAF截止值（在任何尸检样本中均无等位基因失衡）
• 尽管在原发肿瘤中chr2存在轻微的DNA拷贝数增加，但这并不影响分析，因为原发肿瘤不用于系统发育推断
• （D）基于所有肿瘤样本中的VAF，将截断突变分相到删除的chrX和保留的chrX
• 突变按其在chrXq上的位置排序
• 每个突变显示的是所有肿瘤样本中的变异等位基因频率（灰色点）；轮廓点表示其VAF通过样本特异性VAF截止值，被分类为克隆突变
• 保留的X染色体上的突变在所有肿瘤中均保留（底部）；删除的X染色体上的突变在lung-1/lung-3中VAF接近零（克隆删除），在RPLN-2和lung-2中VAF较低（亚克隆删除），在liver-4/MedLN中VAF减少（全基因组复制后的克隆染色体丢失）
• 每个肿瘤样本中chrX上所有截断突变的VAF分布显示在右侧

• 图 S6. TRCC18 中的节段性拷贝数改变和演化，与图 4 和图 5 相关 (A) 单倍型特异性 DNA 拷贝数（灰色和黑色点，100 kb 间隔）和 chr9 的重排。展示的是肝脏-1 转移灶（代表创始肿瘤克隆的祖先改变）的数据，快速尸检时取的正常肾脏和正常肝脏样本显示轻微的 chr9 损失，表明存在肿瘤细胞（灰色点低于黑色点），以及肾切除术（原发肿瘤切除）时取的正常邻近肾脏组织显示完全的等位基因平衡（灰色点覆盖在黑色点上）。由于存在污染的肿瘤细胞，我们排除了两个正常尸检样本进行突变分析。
• (B) 在 MedLN 样本（完全删除）、肝脏-4（末端删除）、肺部-1（具有不同边界的末端删除）和 RPLN-2（完全删除）中检测到的 chr22q 独立删除。这些删除在其余的肝脏转移灶中不存在，并且在原发灶中的克隆分数较低。有趣的是，所有删除都发生在同一 22 同源染色体上；我们不能排除这些删除可能源于不稳定 chr22q 的渐进性删除，因此它们是相关的。
• (C) 与 14q 末端删除相关的 chr6 染色体碎裂，两者都被推断为祖先（见图 4）。黑色弧线代表染色体内连接点，品红色垂直线代表由染色间连接点连接的 chr6 和 chr14 断点。chr6 上断点的聚集与我们之前研究的 RCC16 和断裂-融合-桥循环中看到的断点聚集非常相似。这种模式与 chr1 和 chrX 之间与 TFE3 融合相关的简单相互易位结果形成对比。
• (D) 推断存在于创始肿瘤克隆中的 17p（左）和 18p（右）上的大节段删除。在肝脏-2（除肝脏-4 以外的其他肝脏转移灶）、肺部转移灶和 RPLN-1 中看到了相同的 17p 和 18p 断点，但在多个转移灶中存在易位染色体 der(17)t(17;18) 的拷贝数增加，这可能是由于阳性选择；肝脏-4/MedLN 病灶在 17p 上显示更大的删除，表明易位染色体的下游演化。值得注意的是，RPLN-1 中 17p 末端附近的斜向拷贝数变异（黑色）在完整的同源染色体（灰色）中不存在；这种模式表明易位染色体的持续演化，这与不同转移样本中看到的变异拷贝数状态和断点一致。
• (E) 肺部转移灶（以肺部-1 为代表）、MedLN/肝脏-4（以 MedLN 为代表）和 RPLN-2 中 der(X)t(1;X) 的独立删除或丢失。在肺部样本中，删除跨越整个 Xq 段（着丝粒至易位断点），但 1p 段较小；相互融合连接点通过易位断点附近的小焦点删除被删除。在 MedLN/肝脏-4 样本中，丢失跨越整个 der(X)t(1;X)，但发生在全基因组复制之后；因此，这必须与肺部转移灶中的删除独立。最后，RPLN-2 中的删除表明 der(X)t(1;X) 的染色体碎裂，部分保留在 chrXq 上，并在 chr1p 和 chrX 之间有复杂重排，这一事件与 MedLN/肝脏-4 独立，因为推断其为克隆或发生在全基因组复制之前；它也独立于肺部转移灶中的删除，因为它们没有共享任何断点。

Para_01

1. SFPQ:TFE3 融合是由 X 染色体和 1 号染色体之间的相互易位产生的（图 5A），这两个易位在五个肝转移灶（肝-1,2,3,5,6）和两个涉及腹膜后淋巴结的转移灶（RPLN-1 和 RPLN-3）中都得到了保留。
2. 因此，这种相互易位是主干性的。
3. 由此，导致致癌易位 der(1)t(1;X)(p34.2;p11.23) [以下简称 der(1)t(1;X)] 和相互易位 der(X)t(1;X)(p34.2;p11.23) [以下简称 der(X)t(1;X)] 之间拷贝数不平衡的缺失在其余样本中是次要的（图 4C；图 S5D）。

• 图5. TRCC18转移灶中der(X)t(1;X)的缺失和丢失表明TFE3融合是通过chr1:chrXi易位产生的
• （A）使用来自肝脏-2的数据总结所有肿瘤样本中的祖先拷贝数改变和重排。左图：CIRCOS图显示了具有拷贝数改变或重排的染色体的单倍型特异性DNA拷贝数（蓝色和红色）和重排（绿色表示染色体内，其他颜色表示染色体间）。互惠的chr1:chrX易位用粗洋红色线突出显示。右图：具有改变DNA拷贝数的染色体（染色体6、8、9、14、17和18）的等位深度分布。"A"指的是具有改变DNA拷贝数的同源染色体，"B"指的是完整的同源染色体；对于染色体9，A同源染色体显示局灶性缺失，而B同源染色体发生完全缺失。缺失的9B同源染色体（拷贝数[CN] = 0）、获得的8A同源染色体（CN = 2）和具有正常DNA拷贝数的区域（CN = 1）的等位深度决定了整数拷贝数状态和亚克隆拷贝数改变的克隆分数（例如，肝脏-2样本中4B同源染色体的次要亚克隆丢失）。参见图S6以了解此案例中其他拷贝数进化的实例。
• （B-D）CIRCOS图和选定染色体的等位深度分布图，显示了（A）中显示的祖先改变后的下游进化。（B）肺-1（作为所有三个肺转移灶的代表）显示大部分der(X)t(1;X)的近克隆缺失（见图S6E），22A的近克隆缺失，以及17A和18A的获得。
• （C）MedLN（作为MedLN和肝脏-4的代表）被推断为近四倍体（4N），基于4A、7A和11A在中位拷贝数状态（CN = 1）之间的存在，介于22A（CN = 0）和基础拷贝数状态（等位深度 = 1；CN = 2）之间。基于此推断，der(X)t(1;X)在全基因组复制后经历了整条染色体的丢失。
• （D）RPLN-2有几个染色体（4A、13A、20A和22A）显示非整数拷贝数状态。尽管我们无法确定亚克隆的数量或其倍性状态，但der(X)t(1;X)、4A和20A的p臂的平均等位深度都低于完全缺失（CN = 0，从9B推断）和基础拷贝数状态（2N基因组中CN = 1或4N基因组中CN = 2）之间的中位数，这种减少不能仅归因于全基因组复制后的染色体丢失，而是意味着在一个或多个亚克隆中发生了完全的染色体删除。
• （E）所有转移性肿瘤中chrXq上体细胞突变的等位分数箱线图。每个突变根据其在所有样本中的等位分数（图S5D）被分相到保留的同源染色体（开放框）或删除的同源染色体（填充框）。肺-1和肺-3样本显示删除的同源染色体上的突变完全缺失。肝脏-4和MedLN显示这些突变的等位分数较低，与丢失一致，但不是删除；保留的同源染色体上突变与删除的同源染色体上突变的平均等位分数的2:1比率也与两个同源染色体之间的2:1拷贝数比率一致。肺-2和RPLN-2都是多克隆的。每个样本中突变的平均等位分数与从推断为在创始克隆中删除的9B的等位深度估计的肿瘤细胞克隆分数一致。MedLN和肝脏-4中保留的同源染色体上突变与删除的同源染色体上突变的平均等位分数比率也与两个同源染色体之间的2:1拷贝数比率一致。另见图S5和S6。

Para_01

1. 我们进一步推断，der(X)t(1;X)的丢失或删除在不同分支中是独立发生的（图5B-5D；图S6E）。
2. 在所有接近二倍体的肺转移克隆中，我们确定发生了包含整个chrXq臂的der(X)t(1;X)的完全删除（图5B）。
3. 在肝-4/纵隔淋巴结（MedLN）克隆中（图5C），我们推断在全基因组复制后发生了der(X)t(1;X)的单拷贝丢失。
4. 我们进一步推断，在RPLN-2转移中存在一个占主导地位的接近二倍体的亚克隆（图5D），其der(X)t(1;X)几乎完全删除。
5. der(X)t(1;X)的丢失或完全删除通过分相到已删除的chrXq的体细胞突变的等位基因分数独立验证（图5E）。

Para_02

1. 尽管在全基因组复制（WGD）后丢失chrXq可能是可以容忍的，无论丢失的是chrXa还是chrXi，但在2N肺转移中chrXq的完全缺失以及RPLN-2中一个优势克隆的近乎完全缺失，提供了强有力的证据，表明易位是在chrXi上产生的。
2. 为了明确证明这一点，我们评估了原发肿瘤和一个肝转移（肝-2）中chrXq上基因的haplotype特异性表达，在这两个样本中chrXa和chrXi都得以保留（图6A），使用基于肺转移（肺-1）中等位基因不平衡确定的haplotype阶段。
3. 通过保留的haplotype（chrXa）近乎完全的单等位基因表达，验证了易位的chrXi起源，唯一的例外是XIST基因（该基因从chrXi单等位基因表达）。

• 图6. chrXi与常染色体易位可导致常染色体沉默和chrXi重新激活
• （A-C）TRCC18原发肿瘤和肝-2转移灶中chrX（A）、chr1（B）和chr7（C）的单倍型特异性转录
• 第一行显示了肺-1（chrX）和MedLN（chr1和chr7）的等位基因不平衡，用于确定这些染色体的单倍型相位
• 第2行和第3行显示了原发肿瘤中的分相DNA等位基因深度和RNA等位基因分数；第4行和第5行显示了肝-2转移灶中的DNA等位基因深度和RNA等位基因分数
• 请注意，chrXq上的单等位基因表达将HapA（改变的同源染色体）确定为chrXi，并通过chrXi上XIST的单等位基因表达进一步证实
• chr1中SFPQ位点端粒侧的等位基因不平衡表明与易位chrXi上XIC顺式的A同源染色体沉默（原发肿瘤中p=1.2e-2，肝-2中p=1.78e-5，通过曼-惠特尼检验比较断点两侧转录本的等位基因分数）
• chr7的双等位基因转录作为阴性对照
• （D）chrXi与常染色体易位的预测转录后果
• （E）通过增加双等位基因Xp表达揭示chrXi表达的部分重新激活
• 所示为与所有二倍体染色体上所有多态性位点的累积分数相比，双等位基因表达的多态性位点的累积分数（从p端到q端）
• （F）通过单核RNA测序评估，肿瘤细胞中总转录产出的增加推断chrXi表达的部分重新激活
• 所示为TRCC18原发肿瘤中不同染色体区域肿瘤核（N=4,118）与正常核（N=172）的平均转录本比率
• 仅在断点端粒侧的Xp区域观察到统计学显著差异（p=6.3e-3；曼-惠特尼U检验），而Xq区域（p=0.48）或二倍体常染色体（p=0.79）则无显著差异
• （G）从TFE3断点端粒侧基因双等位基因表达增加推断chrXi重新激活的额外示例
• 所示为以下类别中选定女性样本chrX上双等位基因表达杂合基因型（红色）和表达基因中所有杂合位点的累积分数（黑色）：（顶行）三个具有常染色体-TFE3融合和chrXp重新激活的tRCC样本（p<0.05，曼-惠特尼U检验）；（底行从左到右）一个tRCC样本、一个ccRCC样本和一个tRCC癌旁正常样本，均无重新激活证据（p>0.05）
• 见图S7了解更多示例
• （H）通过RNA-seq评估的15个女性tRCC样本中有无双等位基因chrXp表达的总结
• 另见图S7和S8

Para_02

1. 这些数据共同明确地表明，chrXi 参与了 TRCC18 中的致癌 TFE3 融合，并进一步显示，来自 chrXi 的非功能性易位 der(X)t(1;X) 在肿瘤进化过程中经历了频繁的次级丢失和缺失。

Transcriptional consequences of Xi:autosomal translocations in tRCC

Xi：常染色体易位在tRCC中的转录后果

Para_01

1. 在TRCC18中识别出chrXi:chr1易位后，我们试图进一步分析chrXi:常染色体易位的转录和表观遗传后果。
2. X染色体的沉默是由非编码RNA XIST的顺式扩散所协调的。
3. 据报道，XCI可能在常染色体:chrXi易位中扩展到常染色体区域，并且异位插入的XIST也能在实验系统中诱导整个常染色体的表观遗传沉默。
4. 与这些观察结果一致，我们在易位断点左侧的chr1区域检测到转录减少（图6B，原发和肝-2）。
5. 这种减少特异性地发生在基于从MedLN转移灶中确定的单倍型上的der(X)t(1;X)。
6. 在二倍体常染色体（chr7）上的双等位基因表达模式，在原发肿瘤和肝-2转移灶中均表现出等位基因平衡，作为此分析的阴性对照（图6C）。

Para_02

1. 致癌性TFE3融合转录本的表达来自der(1)t(1;X)，这表明沉默的chrXp臂至少部分被重新激活（图6D），这与正常体细胞分裂中X染色体失活（XCI）的稳定维持形成对比。
2. 为了确定X染色体重新激活的程度，我们评估了受X染色体失活影响的基因（非逃逸基因）的等位基因表达。
3. 我们观察到，与chrXq臂相比，TFE3断裂点远端的chrXp臂端粒区域的基因双等位基因表达显著增加（图6A；原代：p = 1.05e−3，肝脏-2：p = 9.04e−15；Mann-Whitney U检验）。
4. 我们进一步对所有二倍体染色体进行了这一分析，发现只有chrX在双等位基因表达中显示出位置偏倚，且转换点恰好位于TFE3断裂点（图6E）。

Para_03

1. 为了进一步证明chrXi的部分再激活，我们对TRCC18原发肿瘤进行了sNuc-seq分析（4,290个细胞核）。
2. 由于X染色体失活在肿瘤细胞中是克隆性的（即所有肿瘤细胞中失活的是同一条chrX同源染色体），而在邻近的正常细胞中是嵌合性的（不同细胞中失活的是不同的同源染色体），我们比较了肿瘤细胞和正常细胞中chrX的总基因表达。
3. 与因chrXi部分再激活而预测的总转录增加一致，我们观察到肿瘤细胞相对于非肿瘤细胞在chrXp臂上的转录输出显著更高，而在chrXq或二倍体常染色体上则没有这种差异（图6F）。
4. 观察到chrXp上双等位基因表达增加和总转录输出增加，而在chrXq上则没有，这为der(1)t(1;X)中TFE3断裂点端粒侧基因的部分再激活提供了正交证据。

Para_04

1. 在确立了chrXp上的双等位基因表达作为tRCC中chrXi重新激活的标志后，我们试图利用这一特征直接从tRCC的bulk RNA-seq数据中检测chrXi:常染色体易位（STAR方法）。
2. 我们将这一分析限制在来自女性tRCC冷冻样本的RNA-seq数据中，所有样本都具有常染色体融合伴侣（由于等位基因表达数据质量较低，排除了FFPE样本50,51；N = 15，来自我们的队列或外部队列）。
3. 在15例中的9例（60.0%）中，我们观察到了chrXp重新激活的证据（图6G和6H；表S5），这表现为TFE3断裂点端粒侧的双等位基因表达富集（图S7A；p < 0.05，Mann-Whitney U检验）以及chrXi重排样本中重新激活基因的转录输出增加（图S7B；癌症基因组图谱[TCGA]：p = 2.71e−4，机构队列：p = 4.54e−6，Mann-Whitney U检验）。
4. 重要的是，我们在相邻的正常样本（由于XCI的镶嵌性，这些样本在整个chrX上显示出一致的双等位基因表达）、TCGA的女性ccRCC样本或剩余的六例女性tRCC中未观察到任何显著的双等位基因表达富集（图6G；图S7A）。
5. 我们注意到，通过bulk肿瘤RNA-seq中的等位基因表达来评估chrXp的重新激活可能会因正常细胞的存在而混淆（这些细胞具有chrXi和chrXa等位基因的混合），并且也受到具有信息性SNVs的重新激活基因数量的限制。
6. 因此，我们探索了几种正交策略来推断在tRCC中是chrXi还是chrXa发生了重排，发现它们与使用双等位chrXp表达作为指标高度一致（表S5和图注）。

• 图S7. tRCC样本中chrXp重新激活的证据，与图6相关
• （A）双等位基因表达的杂合位点的累积分数（顶部），仅来自非逃逸基因的转录本的次要等位基因分数（中部），以及图6G中显示的样本的chrX拷贝数（具有chrXp重新激活的tRCCs：TRCC18, TCGA-G7-7501, TRCC17；无chrXp重新激活的tRCCs：TCGA-B0-5705；ccRCC：TCGA-T7-A92I；tRCC癌旁正常组织：TCGA-B0-5705-N）
• 双等位基因表达的累积分布（红色）与具有杂合多态性的所有转录基因的累积分布（黑色）一起显示
• p值通过Mann-Whitney U检验计算，比较TFE3断点左侧和右侧杂合位点的次要等位基因分数分布
• （B）具有chrXp重新激活的样本和没有chrXp重新激活的样本中双等位基因表达基因（RNA MAF ≥ 0.2）的标准化表达水平
• 基因表达通过非重新激活队列的平均表达进行标准化
• 左侧：TCGA；右侧：本研究
• p值通过Mann-Whitney U检验计算
• （C）每个样本中TFE3左侧（红色，N = 109个探针）或右侧（棕色，N = 316个探针）所有非逃逸基因启动子中的甲基化（通过beta值量化）
• 样本按chrXp重新激活状态分组
• p值通过Mann-Whitney U检验计算
• （D）在具有chrXp重新激活证据的样本（N = 5）中，TFE3左侧显示双等位基因表达（RNA MAF ≥ 0.2）的基因启动子（±1 kb从外显子1起始）的甲基化，与所有tRCCs整个chrX上显示单等位基因表达（RNA MAF < 0.2）的基因进行比较（棕色）
• p值通过Mann-Whitney U检验计算

Para_04

1. 最后，鉴于在TRCC18病例中观察到chrX沉默向常染色体区域的顺式扩散的证据（图6B），我们调查了如上所述推测存在chrXi易位的样本，并在TRCC17和外部队列中的另一个病例中识别出潜在的常染色体沉默（图S8A）。

• 图 S8. 与 XCI 扰动相关的长距离转录变化的额外示例，与图 6 相关
• （A）女性 tRCC 中常染色体沉默的示例
• chr1 在表达的种系杂合位点（SNVs）上的等位 RNA 分数概要，绘制方式类似于图 6G 和 S7A
• 染色体上的分段 DNA 拷贝数也显示出来
• p 值通过 Mann-Whitney U 检验计算，比较杂合位点左侧和右侧的次要等位基因分数分布
• （B）野生型（WT）和 TFE3 融合蛋白在一系列具有 TFE3 融合的细胞系中的 Western blot
• tRCC: UOK146 [PRCC-TFE3], S-TFE [ASPSCR1-TFE3]; 肺泡软组织肉瘤: ASPS-1 [ASPSCR1-TFE3], ASPS-KY [ASPSCR1-TFE3] 和 TFE3 融合阴性的 ccRCC 细胞系 786O
• tRCC 系列中的单一带表明只有一种 TFE3 蛋白种类（即 chrXa 融合）；双带表明有两种不同的 TFE3 蛋白，一种由 chrXi 易位产生的融合转录本，另一种对应于 chrXa 的 WT TFE3
• （C）TFE3 Western blot，使用强力霉素诱导的短发夹 RNA（shRNA）介导的 TFE3 敲低，在 ASPS-KY 和 S-TFE 细胞中，目标序列位于 TFE3 3′ UTR，证明两条带均代表 TFE3 种类
• （D）在 S-TFE（左）和 UOK146（右）中常见多态性位点上评估的等位 chrX 表达，底部显示分段 DNA 拷贝数
• 在 23Mb 区域（chrX:26,139,329–49,028,726）中，两种细胞系均显示杂合性，我们在 s-TFE 中观察到双等位表达，而在 UOK146 中没有，表明 s-TFE 中可能存在 chrXi 融合，伴随部分 Xp 再激活
• （E）两个与 chrX:常染色体融合相关的双等位 chrXp 表达示例，提示部分 Xp 再激活（TCGA-24-1424 和 TCGA-N8-A4PN），以及两个无 chrX 再激活的代表性样本（TCGA-X6-A7WB 和 TCGA-FU-A3TX）
• 数据展示方式同图 S7A
• 双等位表达通过以下标准评估：RNA 次要等位基因分数 ≥ 0.2，阈值 ≥ 10 DNA 读数和 ≥ 10 RNA 读数
• （F）两个与 Cancer Cell Line Encyclopedia 中细胞系的 X-失活中心缺失相关的双等位 chrX 表达示例（HCC-366 和 LMSU）
• chrX 上删除的区域以蓝色阴影显示
• 显示一个单等位 chrX 表达的代表性示例作为参考（CL-40）

Para_04

1. 总之，我们的RNA-seq分析表明，chrXi:常染色体易位可以导致长距离的表观遗传变化，包括与chrXq上的X失活中心顺式相连的常染色体区域的局部沉默，以及与常染色体融合的chrXp的局部再激活（图6D）。

Epigenetic changes due to chrXi rearrangements in tRCC

由于tRCC中chrXi重排导致的表观遗传变化

Para_01

1. 在正常条件下，X染色体失活是稳定的，并且chrXi上大多数基因通过其启动子区域的DNA甲基化在表观遗传学上被沉默。
2. 为了确定chrXi：常染色体易位是否能够逆转这些稳定且可遗传的表观遗传标记，我们分析了来自TCGA队列的9个tRCC样本（最初被误分类为ccRCCs），这些样本具有DNA甲基化、RNA-seq和全外显子测序（WES）数据。
3. 使用我们上述的方法，我们推断出四个样本具有chrXa易位，五个样本具有chrXi易位。

Para_02

1. 我们在所有样本中观察到，无论chrXi/chrXa重排状态如何，TFE3断点左侧与右侧非逃逸基因启动子处的DNA甲基化没有显著差异（图S7C）；值得注意的是，这种检测中通常可以明显看出男性和女性之间chrX甲基化的差异。
2. 由于最近一项研究表明，启动子低甲基化的一小部分chrX基因最依赖于XIST，54我们接下来专门评估了重新激活基因启动子处的DNA甲基化。
3. 确实，在显示chrXp重新激活的肿瘤中，chrXp上重新激活的基因（定义为RNA突变等位基因频率[MAF]≥0.2）被相对低甲基化区域所环绕，与非重新激活基因（MAF<0.2）相比（p=8.69e−4，曼-惠特尼U检验，图S7D）。
4. 总体而言，我们的数据表明，由于体细胞chrXi重排导致的X重新激活可能优先影响甲基化基础水平较低的位点，从而导致一部分chrXp基因的表达增加。

chrXi rearrangements in other tumor types

chrXi在其他肿瘤类型中的重排

Para_01

1. chrXi重排的发现是致癌TFE3融合的基础，这促使我们研究是否类似的机制在其他癌症中也可能活跃。
2. 我们首先回顾了其他罕见肿瘤类型中TFE3融合的性别分布，尤其是肺泡软组织肉瘤（ASPS，以ASPCSCR1-TFE3融合为特征）和YAP1-TFE3血管内皮瘤。
3. 这两种肿瘤类型均表现出接近2:1的女性性别偏倚，这表明tRCC中归因于TFE3重排的相同机制也适用于这些不同的恶性肿瘤。
4. 此外，我们鉴定了tRCC和ASPS的细胞系模型，这些模型显示出chrXi重排和X染色体再激活的特征（图S8B-S8D）。
5. 值得注意的是，这些癌症中比tRCC更明显的女性偏倚可能是由这些癌症中常染色体伴侣的占主导地位所解释的（而不是像tRCC那样常染色体和chrX伴侣的混合）.

Para_02

1. 我们进一步注意到，由X染色体短臂（chrXp）上的FOXR2基因激活驱动的神经母细胞瘤的一个罕见亚型（中枢神经系统神经母细胞瘤-叉头框R2 [CNS NB-FOXR2]）在多个队列中被报告存在强烈的女性性别偏倚（26/44 [59%] 女性；8/11 [73%] 女性；15/20 [75%] 女性）。
2. 在CNS NB-FOXR2中，FOXR2可以通过扩增和/或复杂结构重排而被激活，这些重排导致融合转录本保留了由融合伴侣的毗邻启动子驱动的FOXR2的C端区域。
3. 值得注意的是，已有几例CNS NB-FOXR2被报告在X染色体上存在大片段缺失（参见Sturm等人图S5）；根据X染色体连锁基因的必要性相同的推理，这些缺失很可能发生在Xi染色体上。

Para_03

1. Xi染色体的重排以及Xi染色体沉默的破坏也发生在其他癌症中。
2. 在我们最近对食管癌的研究中，我们基于单倍型特异的DNA拷贝数改变，在Xa染色体和Xi染色体上均发现了节段性改变。
3. 对来自TCGA和癌症细胞系百科全书（CCLE）的RNA-seq数据的分析也揭示了伴随X染色体重排的双等位X染色体表达的例子（图S8E和S8F）。
4. 综合这些观察结果，表明致癌的Xi染色体易位可能有助于多种融合驱动癌症中的女性性别偏倚，并且Xi染色体重排及其后续的表观遗传/转录改变也发生在tRCC之外的其他癌症类型中。

Discussion

Para_01

1. 我们对tRCC的综合基因组学和转录组学分析，结合对多个先前研究数据的查询，提供了对TFE3融合病因的见解，并揭示了chrX重排的重要特征。

Para_02

1. 我们发现TFE3融合几乎总是通过相互重组产生，重组过程中涉及的每条染色体上的断裂点几乎没有遗传物质的丢失或增加（包括在染色质重组的案例中）。
2. 这与在其他肿瘤中的致癌融合形成对比（例如，尤文肉瘤中的EWSR1-ETS融合，前列腺癌中的TMPRSS2-ERG融合，肺癌中的EML4-ALK融合，或慢性髓系白血病中的BCR-ABL融合），在这些肿瘤中，有一部分融合是由染色质重组、染色质碎裂或其他涉及多条染色体的复杂重组产生的。
3. 我们观察到在相互融合断裂点处微同源性/插入和DNA丢失/增加最小，这表明其起源于近钝性双链断裂后的c-NHEJ。
4. 在体内tRCC前体细胞中产生近钝性双链断裂的确切机制仍有待阐明。
5. 这一观察结果还提出了一个问题，即通过相互易位或染色质重组并在配对断裂末端之间有10-100 kb缺失的融合产生的癌症是否受到不同的DNA断裂和修复机制的影响。

Para_03

1. 我们建议，频繁保留编码非致癌TFE3融合的互易衍生染色体反映了chrX转录所施加的限制。
2. 由于在男性和女性中chrXa的单等位基因转录以及chrX上存在许多必需基因，chrXa上的大片段缺失是不可容忍的（尽管在全基因组复制后chrXa的丢失可能是可容忍的）。
3. 相比之下，chrXi的节段性或整条染色体缺失是可容忍的，并且可能在女性癌症中频繁发生。
4. 鉴于chrXa与chrXi上拷贝数改变所带来的截然不同的后果，等位基因特异性拷贝数分析对于揭示涉及chrX的变异的功能影响至关重要。
5. 对chrXi或chrXa变异的探究需要长范围的等位基因信息，这些信息不能直接从短读测序数据中获得。
6. 我们的研究展示了通过结合统计相位分析、等位基因失衡和肿瘤克隆中的单等位基因chrX表达来克服这一困难的几种策略。
7. 这些方法可推广到其他癌症，并将它们纳入未来的癌症基因组分析中将进一步了解chrX变异如何影响癌症进化。

Para_04

1. 我们提供了确凿的证据，证明TFE3融合可以源自chrXi，并且这种易位至少部分重新激活了chrXi的p臂。
2. 这些发现与最近报道的癌症细胞中XCI的体细胞扰动的 studies 一致。
3. 此外，chrXi可以通过chrXi:常染色体易位反复用于TFE3融合的事实，为tRCC中观察到的女性性别偏倚提供了遗传学解释，其惊人的chrX:常染色体易位的女性-to-男性比例为2:1。
4. 许多癌症在男性和女性之间的发病率或结局存在差异，这些差异不能仅通过生活方式、环境或激素因素的不同来完全解释。
5. 我们提出，chrXi:常染色体易位代表了一种女性特有的致癌过程，这可能是其他由X连锁致癌基因驱动的癌症中女性占主导地位的基础。
6. 更广泛地说，性染色体的基线遗传学可能导致了癌症中的性别特异性表型。

Para_05

1. 我们还显示，chrXi:常染色体易位在某些情况下与常染色体基因的部分沉默有关。
2. 后一类事件可能通过转录抑制常染色体肿瘤抑制基因来促进肿瘤发生。
3. 例如，我们发现许多具有SFPQ-TFE3融合的tRCCs缺失了chr1p区域。
4. 该区域包含ARID1A，一个SWI/SNF组分和肿瘤抑制基因，其单倍体不足和/或改变已被证实与肾癌和其他癌症类型的肿瘤发生有关。
5. 我们推测，通过chr1:chrXi融合下调ARID1A可能是另一种使该肿瘤抑制基因失活的机制，这一过程可能与SFPQ-TFE3融合的产生同时发生。
6. 也可以设想，涉及chrXi的易位可能通过长距离表观遗传沉默在多种癌症类型中参与其他肿瘤抑制基因的失活，尽管这一现象的普遍性仍有待系统性地探索。

Para_06

1. 先前在实验系统中的研究表明，X-失活中心（XIC）的破坏通常对维持XCI有轻微影响，尽管表型会根据具体情境而有所不同。
2. tRCC代表了一种生理情境，其中chrX的一个大片段与XIC物理断开，而常染色体片段则以顺式与XIC结合。
3. 因此，tRCC代表了一个遗传学上定义明确的模型，用于研究癌症中XCI体细胞可塑性的机制。
4. 鉴于chrXi的独特特征，包括其表观遗传状态、染色质超微结构、物理位置和DNA复制时间，可以想象体细胞chrXi重排可能表现出选择性依赖。
5. 更广泛地说，涉及chrXi的体细胞重排可能在其他癌症中导致性别特异的转录差异。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_07

1. 基于双等位基因转录的chrXa/chrXi易位推断可能会受到样本质量和其他因素的影响，包括正常组织污染（因为XCI在正常组织中是嵌合的）。
2. 通过优先选择肿瘤纯度较高的样本和冷冻组织来源的数据，在细胞系模型中验证结果，以及通过基因组测序数据进行验证，来减轻这种影响。
3. 未来的全基因组测序研究需要涵盖多种癌症类型，并整合多种模态（包括DNA甲基化和其他表观遗传标记），以全面定义chrX重排对癌症的影响。
4. 此外，定量评估原发肿瘤样本中X染色体再激活的程度及其潜在机制是困难的，这需要未来的实验研究。