综述精读 | TrendsCancer | 锯齿状结直肠癌：临床前模型和分子通路

Basic Information

• 英文标题： Serrated colorectal cancer: preclinical models and molecular pathways
• 中文标题：锯齿状结直肠癌：临床前模型和分子通路
• 发表日期：24 October 2023
• 文章类型：Review
• 所属期刊：Trends in Cancer
• 文章作者：Aziz Aiderus | Vinay Tergaonkar
• 文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405803323001954

Highlights

• ‘锯齿状’途径是一种发展结直肠癌（CRCs）的替代路径，具有独特的特征，如BRAF突变的富集、广泛的CpG岛甲基化以及微卫星不稳定性。
• BRAF中的激活突变在锯齿状CRC中富集，并被提议为起始的遗传事件。然而，仅BRAF激活不足以引发肿瘤形成，疾病进展所需的额外事件尚不清楚。
• 体内和体外模型在重现逐步遗传事件和支撑肿瘤发生机制的研究中一直很有用。
• 然而，锯齿状结直肠癌的肿瘤位置和分子特征需要仔细选择Cre品系，以便在体内靶向遗传事件，确保所发生的肿瘤忠实地再现人类疾病的特征。
• 类器官模型还需要整合外部因素，如基质细胞和免疫细胞，以及微生物组的成分，以更贴近地模拟人类疾病。

Abstract

Para_01

1. 齿状病变在组织学上是异质的，检测这些病变可能具有挑战性，因为这些病变的特征较为微妙，可能会在内窥镜检查中被忽视。
2. 此外，尽管约30%的结直肠癌（CRC）源于齿状病变，但仅有8-10%的侵袭性齿状CRC在表现时具有齿状形态，表明随着恶性程度的增加，显著特征可能会丧失。
3. 因此，理解驱动齿状CRC起始和进展的遗传基础对改善诊断并识别治疗生物标志物和靶点，以指导疾病管理至关重要。
4. 本综述讨论了迄今为止报道的齿状CRC的临床前模型，以及这些系统如何用于提供关于肿瘤起始、进展和新治疗靶点的机制见解。

Keywords

• serrated colorectal; mouse models; organoids; BRAFV600E; initiation and progression; microbiome

Clinical and molecular features of serrated CRC

Para_01

1. 锯齿状腺瘤的最早描述出现在20世纪90年代，但由于对这些病变的组织学和潜在分子特征的了解不足，它们在临床实践中很大程度上被忽视了。
2. 自2000年以来，几项研究进一步定义了这些病变的形态学和分子相关性，并证明了锯齿状腺瘤与癌症风险之间的联系。

Para_02

1. 高达30%的散发性结直肠癌通过锯齿状途径发展
2. 它们是间隔癌（定义为在阴性结肠镜检查后60个月内诊断出的结直肠癌）的主要原因之一
3. 并与同步癌（在初次癌症诊断后6个月内诊断出的第二种癌症）和异时癌（在第一种癌症诊断后超过6个月诊断出的第二种癌症）相关
4. 从流行病学角度来看，锯齿状结直肠癌（见词汇表）在老年人中更为常见，通常是女性，且多发生在结肠右侧
5. 世界卫生组织消化系统肿瘤分类第五版将锯齿状结直肠病变分为三类：（一）增生性息肉（HPPs），（二）伴或不伴异型增生的无蒂锯齿状病变（SSLs），以及（三）传统锯齿状腺瘤/息肉（TSA）

Para_03

1. HPPs是最常见的锯齿状息肉，占锯齿状病变的60%至75%。
2. HPPs通常较小（<5毫米），位于结肠左侧，呈现扁平或无蒂形态。
3. HPP的隐窝是直而细长的，上三分之二表现出锯齿状结构，细胞学异型性最小。
4. 隐窝底部的三分之一是规则的，既无锯齿也无异型性。
5. HPPs可以根据粘液类型进一步细分为微泡型增生性息肉（MVHPs）和杯状细胞丰富型增生性息肉（GCHPs）。
6. MVHPs约占HPPs的60%，并与SSLs具有共同的分子特征。
7. 相比之下，GCHPs约占HPPs的30%，在分子水平上与TSAs更为相关。
8. SSLs占所有锯齿状病变的20%至35%，无腺瘤性改变，通常比常见的有蒂息肉状传统腺瘤更扁平。
9. SSLs通常位于右侧（近端），尽管有20%至40%的报告显示它们出现在远端（左侧）。
10. SSLs的直径在5至10毫米之间，可以细分为有异型性和无异型性的病变。
11. 大约4-8%的SSLs有异型性焦点，其特征为嗜酸性胞浆和小而紧密排列的腺体。
12. 有几个组织病理学特征对于识别SSLs很重要：（一）沿肌层黏膜呈T形或L形的水平生长，（二）隐窝底部三分之一扩张，锯齿延伸至其中，（三）增殖区从隐窝底部转移到扩张的侧边。
13. TSAs是最不常见的，占所有锯齿状病变的<1%，通常直径>5毫米，定位于远端结肠。
14. 与HP和SSA/P相比，TSAs可以呈现无蒂或有蒂的形状。
15. 这些病变在组织学上呈现扭曲的绒毛状或管状绒毛状结构，绒毛 frequently having bulbous tips.

Para_04

1. 与通过传统途径发展的结直肠癌（CRC）相比，锯齿状结直肠癌很少出现APC和KRAS基因的突变，并且染色体稳定（图1）。
2. 然而，尽管缺乏失活的APC突变，Wnt信号可以通过其他机制激活，例如通过RNF43的失活突变[13,14]。
3. 锯齿状结直肠癌富含BRAFV600E激活突变，并且与微卫星不稳定性（MSI）和CpG岛甲基化表型（CIMP）密切相关。
4. MSI是由于错配修复（dMMR）途径缺陷通过表观遗传沉默或途径中基因的失活突变引起的。
5. 最常见的事件是MLH1上游启动子位点的甲基化以及其他MMR基因（如MSH2、MLH1、MSH6、PMS2和PMS1）的失活种系突变，特别是在遗传性非息肉病性结直肠癌中[15]。
6. 值得注意的是，较小比例的锯齿状结直肠癌是微卫星稳定的（MSS），并且与预后不良相关[16]。
7. CIMP状态是基于对五个基因甲基化水平的评估确定的，至少三个基因的甲基化被认为是CIMP高，而一个或两个基因的甲基化被认为是CIMP低[17,18]。
8. 还提出了其他基因面板[19]，这在比较不同研究中的CIMP状态时提出了挑战。
9. 总的来说，锯齿状结直肠癌在所有结直肠癌病例中相对较小比例的特征中表现出富集，这对早期检测和辅助治疗有影响。
10. 已经报道了结直肠癌的分子亚型，锯齿状结直肠癌在共识分子亚型1和最近定义的内在分子亚型3中富集[20,21]。

• 图1. 锯齿状和传统结直肠癌（CRC）之间的关键特征。

Para_04

1. 虽然锯齿状结直肠癌的临床相关性已经明确，但对驱动肿瘤发展的遗传学和信号通路的深入理解仍然不足。
2. 临床前模型在理解肿瘤发生和对各种治疗方式的反应中已被证明是必不可少的，近期研究详细描述了锯齿状结直肠癌发展中的起始和进展机制。
3. 本综述旨在综合迄今为止报道的各种临床前模型，重点关注基因工程小鼠模型。
4. 在此过程中，我们突出了在体外和体内模型中锯齿状结直肠癌发展所必需的生物学过程和通路，并提出了未来研究的方向。

Preclinical models of serrated CRC

BrafV600E is a key initiating hit in driving precursor serrated lesions

BrafV600E是驱动前体锯齿状病变的关键起始打击

Para_01

1. BRAF原癌基因的激活突变在超过60%的前体增生性或锯齿状隐窝灶中出现，而在非锯齿状病变中仅占6%，这表明BRAFV600E突变在早期锯齿状病变中具有起始作用。
2. 最常见的突变是核苷酸1799处的CTG→CAG，导致第15外显子中残基600处的氨基酸从缬氨酸替换为谷氨酸。
3. 这产生了一种组成性活性的酶，估计其激酶活性是野生型分子的500倍。

Para_02

1. 最早的一项研究通过使用AhCreERT2小鼠在肠道干细胞和过渡扩增细胞中激活致癌的BrafV637E（人类BRAFV600E的同源基因），功能性展示了其启动作用。
2. 条件性激活该激酶导致初始的过度增殖爆发，进而形成HPP病变，随后在p16肿瘤抑制因子的驱动下进入衰老。
3. 确实，删除Cdkn2a（编码p16蛋白的基因）绕过了这种休眠状态，推动了向侵袭性锯齿状CRC的进展。
4. 第二项研究使用Villin-Cre小鼠驱动肠道组织特异性表达BrafLox-Stop-Lox(LSL)-V637E/+。
5. 这导致了持久且终生的隐窝过度增生，其特征为锯齿状上皮特征，形态上与人类MVHP或GCHP相似。
6. 此外，在2个月大时即可观察到过度增生向异型增生的进展，此时一些动物已经形成了肉眼可见的肿块。
7. 然而，在10个月以下的Vil-Cre;BrafLSL-V637E/+小鼠中，只有1只（8%）以及在10个月以上的29只中有4只（13.8%）发展成了侵袭性癌症，其中2只为低级别（良好/中度分化），3只为高级别（差分化或未分化，肿瘤中少于50%表现出腺体结构）。
8. 这些发现在一个独立的研究中得到了证实，该研究使用了多西环素诱导表达的BrafV600K转基因版本。
9. 与前两项研究一致，这导致了肠道形态的显著变化（例如，锯齿状绒毛、绒毛尖端聚集的肠细胞簇、上皮细胞核基底定位的丧失、核增大以及核质比增加）。
10. 值得一提的是，在锯齿状病变中检测到了KRAS突变，并且在小鼠肠道中Vil-Cre驱动的致癌Kras激活导致了锯齿状过度增生和衰老。
11. 总的来说，这些发现表明Braf激活（或丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的激活）足以启动肠道过度增生，但在缺乏其他遗传事件的情况下，这种过度增生向侵袭性癌症的进展效率较低。

Para_03

1. 尽管小鼠模型对于研究锯齿状结直肠癌的发展很有用，但肿瘤发生所需的时间对进行基因筛选和短期治疗研究构成了挑战。
2. 最近，类器官系统被提出作为模拟疾病发展的替代方法。
3. 由患者来源的HP和SSA/P的类器官培养最初由Toshiro Sato团队报道。
4. 随后，从Villin-Cre;BrafV637E小鼠中建立的结肠类器官用4-羟基他莫昔芬处理以诱导致癌激酶活性，从而建立了一个体外系统来研究锯齿状结直肠癌的发展。
5. 作者随后通过CRISPR-Cas9系统测试了Tgfbr2、Rnf43、Znrf3、p16Ink4a和Mlh1的逐步破坏。
6. 仅具有Braf激活的类器官的正位移植未生成肿瘤，而Braf激活与Tgfbr2、Cdkn2a、Znrf2和Rnf43的失活突变相结合则频繁导致肿瘤形成（57–100%），且肿瘤形成率与基因变异数量的增加相关。
7. 另一项研究通过染色体工程模拟人类较少见的TSA，使用人类结肠类器官模拟RSPO1基因融合，以及TP53、BRAF和GREM1的基因变异。
8. 携带BRAFV600E和R-spondin 1融合的类器官在小鼠中形成了平坦的锯齿状病变，而具有BRAFV600E、R-spondin 1融合和GREM1过表达的类器官形成了表现出人类TSA特征的肿瘤。
9. 总体而言，这些研究表明类器官系统再现了人类锯齿状结直肠癌的一些特征，并可能作为基因和药物筛选的有用模型。

Para_04

1. 肿瘤类器官的一个普遍限制是缺乏其他细胞类型，包括基质细胞、血管细胞和免疫细胞。
2. 这些细胞类型很可能在肿瘤发生中起作用，因此可能会影响机制研究的解释以及药物筛选，这需要更复杂的类器官系统。
3. 更近期的例子包括在胰腺导管腺癌、肾细胞癌和非小细胞肺癌以及黑色素瘤中成功培养含有成纤维细胞或免疫细胞的肿瘤类器官，以及将成纤维细胞与小鼠肿瘤类器官或结直肠癌细胞共培养以形成三维器官型生长。
4. 在类器官生成和培养中要包含的细胞类型可以通过对患者的锯齿状息肉和肿瘤进行单细胞和/或空间转录组学分析来确定优先级。
5. 配体-受体相互作用分析可能识别肿瘤上皮与其环境之间相互作用的关键介质；关键细胞类型可以被分离并与肿瘤类器官共培养。

BrafV600E activation, aging, and global genomic hypermethylation

BrafV600E激活、衰老与全基因组高甲基化

Para_01

1. 大约一半的SSLs表现出CIMP，大多数高级异型增生的SSLs也是CIMP阳性，这表明CIMP是必要的，并且在SSL演变过程中早期出现。
2. 三项研究中对病人材料的分析显示，与CIMP低度息肉和CRC相比，BRAF突变与CIMP高度锯齿状息肉和CRC之间存在强关联，这表明BRAF激活与全基因组高甲基化之间存在关联。

Para_02

1. 早期研究表明，BRAFV600E与促进转化和锯齿状结直肠癌发展的表观遗传标记的积累之间存在强关联。
2. BRAFV600E激活是如何驱动全局高甲基化的呢？
3. 尽管机制理解尚不完整，但一项研究通过RNAi筛选识别MLH1沉默的中介物，提出了一个可能的解释，并确定MAFG（MAF BZIP转录因子G）为一个强有力候选物。
4. 由于用于此筛选的RKO细胞系携带BRAFV600E突变，作者评估了抑制激酶活性是否影响MAFG、其与其他共抑制因子的相互作用以及MLH1沉默。
5. 通过药物或遗传抑制BRAFV600E，导致RKO细胞系中MAFG表达减少和MLH1甲基化降低。
6. 此外，在初级包皮成纤维细胞中过表达BRAFV600E增加了MAFG水平并降低了MLH1表达。
7. 机制实验表明，细胞外信号调节激酶（ERK）依赖的磷酸化促进MAFG稳定性，防止其被蛋白酶体降解，且ChIP分析显示MAFG与BACH1相互作用，招募如DNMT3B和CHD8等共抑制因子到复合物中。

Para_03

1. 自那时以来，几项研究提供了实验证据，表明BrafV600E激活和基因启动子高甲基化在更高模型系统中，如基因工程小鼠和类器官培养中，具有直接作用。
2. 例如，在小鼠肠道特异性激活BrafV600E导致预定义基因面板的启动子高甲基化呈时间依赖性增加。
3. 进一步研究这一发现，从BrafV600E小鼠的近端结肠中衍生出类器官，类器官的初始传代经历了细胞死亡。
4. 然而，在含有生态位因子（包括表皮生长因子（EGF）、Noggin、R-Spondin 1和Wnt3a）的培养基中长时间（11周）培养类器官，导致了生长并伴随肿瘤性表型变化，如发育不良和隐窝样干细胞芽向内生长，息肉样生长填充内腔。
5. 长期培养（5个月）生成的类器官获得了对生态位因子的独立性，并在Wnt信号通路的负调节因子、衰老的关键抑制因子p16Ink4a和CRC肿瘤抑制基因Cdx2中发生了深刻的全球甲基化变化。
6. 在BrafV600E类器官中观察到的许多甲基化基因在人类近端CIMP阳性的CRC中高度保守，这表明该模型系统的临床相关性。
7. 值得注意的是，长时间培养（12-14个月）的空载体（野生型对照）类器官实现了对Noggin或Wnt3a补充的独立性，并在与BrafV600E类器官培养5个月的同一组基因中表现出启动子甲基化。

Para_04

1. 考虑到这些发现，评估了衰老、DNA甲基化与BRAF激活之间的关系，通过分析小鼠断奶后24天至20个月近端小肠的DNA甲基化状态。
2. 8%的全局CpG位点与衰老显著相关，称为A型（与年龄相关），包括在105个肿瘤抑制基因中，如Cdkn2a和Dkk3。
3. 本研究与之前描述的研究[43]的甲基化谱有限的重叠，这可能是由于后者长期培养环境、动物性别差异以及研究间不同组织来源（此处为小肠 vs. 结肠[43]）。
4. 进一步分析断奶后10天至14个月具有BrafV600E激活的小鼠的与年龄相关的DNA甲基化，发现16.8%的全局CpG位点与衰老相关，其中81.3%是A型位点的组成部分。
5. 此外，Braf激活导致69.5%的与年龄相关的CpG位点甲基化速率不同，称为AB型（与年龄相关并由Braf激活修饰）。
6. AB型基因启动子与A型相比，也显示出对WNT信号传导的更强富集，表明衰老与Braf/MAPK激活在选择小鼠小肠中WNT信号传导的表观遗传调控中存在相互作用。
7. 这一发现也挑战了普遍观点，即锯齿状CRC在BRAF激活和锯齿状病变启动后随时间发展。
8. 事实上，在激活Braf前已衰老9个月的动物（Braf9–14）中，锯齿状病变的发生率大约高出十倍（43.8% vs. 4.2%），与断奶后激活Braf 5个月的小鼠（BrafW-5）相比，表明衰老的肠道显著改变了Braf诱导的锯齿状肿瘤的倾向。
9. 总的来说，这些发现表明衰老及其相关的肠道表观遗传改变可以迅速驱动BRAF激活后的锯齿状病变。

Genetic hits and pathways associated with serrated CRC progression

Para_01

1. BRAFV600E 在锯齿状息肉的起始中起着关键作用。
2. 然而，驱动良性病变进展为恶性锯齿状结直肠癌的遗传事件尚不清楚。
3. 在本节中，我们重点介绍了BrafV600E诱导的病变进展为侵袭性疾病所需的遗传事件（图2，关键图，以及图3）。

• 图2. 关键图示。从体内研究中涉及的锯齿状结直肠癌（CRC）发展的途径。

• 图3. 讨论的研究时间线，这些研究调查了驱动锯齿状结直肠癌（CRC）进展的遗传事件。

Trp53 and Cdkn2a loss

Trp53和Cdkn2a的缺失

Para_01

1. Braf的激活会导致衰老，这一过程可以通过删除Cdkn2a来绕过，这表明绕过细胞周期检查点是疾病进展的一种机制。
2. TP53基因在肿瘤发生中具有多种作用，但主要作为细胞周期的关键调节因子。
3. 在另一项研究中，Vil-Cre;BrafLSL-V637E/+;p53LSL-R172H/+小鼠与Vil-Cre;BrafLSL-V637E/+小鼠相比，其异型增生病变数量相似，尽管前者相对于Vil-Cre;BrafLSL-V637E/+小鼠有更多的侵袭性癌变。
4. 此外，Vil-Cre;BrafLSL-V637E/+;p16Ink4a⁎和Vil-Cre;BrafLSL-V637E/+小鼠在锯齿状腺瘤的数量上没有差异，但平均癌变发生率增加了六倍，其中一些发生了转移。
5. 值得注意的是，TP53突变在锯齿状息肉中较为罕见，而锯齿状息肉或癌变中功能获得性p53R172H突变的频率尚未明确。
6. 尽管如此，这些发现表明，在体内，p53和p16等细胞周期调节因子的失活可以驱动由Braf驱动的锯齿状腺瘤的恶性进展。

Dedifferentiation associated signaling

去分化相关信号

Para_01

1. 转化生长因子（TGF）-β通路中的突变至少发生在30%的BRAF突变型结直肠癌和锯齿状息肉中。
2. 然而，TGF-β通路激活对锯齿状结直肠癌进展的贡献在很大程度上尚未被探索。
3. 两项最近的研究开发了基因工程小鼠模型，以研究不同TGF-β通路成员的缺失如何与Braf激活协同驱动锯齿状结直肠癌的发展。
4. 第一项研究报道了在Vil-CreERT2系小鼠中，通过肠道激活Braf的条件性敲除Alk5/Tgfbr1或Tgfbr2。
5. 单独Alk5缺失或Braf激活后的中位无瘤生存期为475-485天，表明TGF-β失活或MAPK信号通路激活本身形成肿瘤的效率低且潜伏期长。
6. 然而，复合BrafV600E激活和Alk5缺失（BrafV600E; Alk5fl/fl）的中位无瘤生存期为192天，表明两种信号通路之间存在协同效应。
7. 虽然BrafV600E肿瘤主要发生在小肠，但BrafV600E; Alk5fl/fl肿瘤主要发生在近端结肠。
8. BrafV600E; Alk5fl/fl肿瘤中Notum、Lgr5或Axin2的表达可以忽略不计，表明Wnt信号通路在这些病变中不活跃。
9. 鉴于BrafV600E; Alk5fl/fl肿瘤中Lgr5+细胞群体规模较小，作者询问这些病变是否表现出先前识别的Lrg5独立胎儿样分化特征（例如，Anxa和Ly6基因家族），这一特征先前在应对电离辐射或葡聚糖硫酸钠（DSS）治疗后的再生过程中被观察到。
10. 确实，对BrafV600E; Alk5fl/fl肿瘤和VillinCreER近端结肠对照组织进行的RNA测序分析显示，胎儿样特征显著富集。
11. 此外，BrafV600E; Alk5fl/fl肿瘤的原位杂交分析显示，胎儿特征中的选定基因，如Ly6a、Anxa1和Krt7，仅在肿瘤上皮细胞中表达。
12. 这种胎儿特征在Alk5缺失和Braf激活后30天被激活，表明它可能在肿瘤起始的早期发挥作用。
13. 值得注意的是，作者生成的BrafV600E; Alk5fl/fl肿瘤基因特征与人类右侧BRAF突变型且被归类为CMS1亚型的结直肠癌肿瘤呈正相关。
14. 因此，Braf激活与Alk5缺失共同驱动胎儿特征和右侧结肠癌的发展。
15. 值得一提的是，BrafV600E本身足以诱导胎儿特征，但形成肿瘤的效率较低。
16. 然而，尚不清楚这种胎儿特征的诱导是否驱动了BrafV600E; Alk5fl/fl模型中的锯齿状结直肠癌，还是包括激活这些基因在内的一个潜在过程的一部分。
17. 由于这些胎儿特征基因主要在上皮细胞中表达，可能它们采取了一种更原始、去分化的状态，这可能使它们易于转化。

Para_02

1. 第二项研究产生了Vil-CreERT2; BrafV600E/+; Smad4KO小鼠，并评估了锯齿状结直肠癌发展的动力学。
2. 与之前的报告一致，Vil-CreERT2; BrafV600E/+; Smad4KO小鼠中最早在2个月时就能观察到宏观肿瘤。
3. 然而，这些肿瘤大多数出现在小肠中，尽管近端结肠黏膜较大，且上皮组织显示出增生。
4. 微卫星分析显示，这些肿瘤是MSS，与之前描述的BrafV600E; Alk5fl/fl肿瘤中出现的MSI肿瘤不同，这表明TGF-β通路不同成分的变异对肿瘤的微卫星状态有不同的影响。
5. 事实上，对AACR GENIE数据集的分析显示，具有BRAFV600E和SMAD4突变的肿瘤的突变负担大约比具有其他TGF-β通路成员突变的BRAFV600E肿瘤低一个数量级。
6. 重要的是，将Msh2敲除引入Vil-CreERT2; BrafV600E/+; Smad4KO小鼠中增加了肿瘤和突变负担，这表明额外的突变加速了肿瘤的发展。
7. 外显子测序分析显示，在Vil-CreERT2; BrafV600E/+; Smad4KO和Vil-CreERT2; BrafV600E/+; Smad4KO; Msh2KO模型中频繁出现Ctnnb1的激活突变和Wnt信号通路的升高。
8. 这一发现与BrafV600E; Alk5fl/fl模型形成对比，后者未表现出Wnt信号通路的激活。
9. 此外，尚不清楚在BrafV600E; Alk5fl/fl小鼠中识别出的胎儿特征是否存在于这个BrafV600E/+; Smad4KO模型中。
10. 因此，TGF-β信号通路不同成员的变异可能需要不同的Wnt信号来加速锯齿状结直肠癌的发展，可能是通过不同的机制。

Para_03

1. CDX2 编码一种来自尾相关基因家族的同源域转录因子，在胚胎发育期间对消化道特化以及肠道细胞的增殖、分化、粘附和凋亡具有重要作用。
2. Cdx2 蛋白从近端十二指肠到远端直肠均有表达，并且已被报道为一种潜在的结直肠癌（CRC）生物标志物，其特征与锯齿状途径密切相关。
3. 然而，Cdx2 丢失在锯齿状 CRC 发展中的致病作用尚未被认识到。
4. 为此，一项研究评估了 KRAS 和 BRAF 突变与 CRC 组织中 CDX2 表达之间的关联，并确定了 CDX2 减少与激活型 BRAF 突变之间存在显著共发生。
5. 基于这种关联，作者使用 Cdx2p-Cre 系列激活 BrafV600E 和/或删除 Cdx2。
6. 仅激活 Braf 或仅删除 Cdx2 的小鼠中位生存期为 480 天，而同时激活 Braf 和删除 Cdx2 的小鼠中位生存期为 103 天。
7. 仅激活 Braf 或仅删除 Cdx2 的小鼠表现出明显的肠道增生，而 BrafV600E 激活和 Cdx2 删除导致在大肠和小肠交界处出现大肿瘤（>10 毫米）和多发性息肉样病变。
8. BrafV600E; Cdx2−/− 肿瘤具有锯齿状和粘液性组织学特征，锯齿状成分的细胞学特征与人类锯齿状 CRC 密切相关。
9. 从粘液性或锯齿状区域分离的 DNA 显示，锯齿状区域同时存在 BrafV600E 激活和 Cdx2 删除，而粘液性区域仅存在 Cdx2 删除。
10. 在 BrafV600E; Cdx2−/− 小鼠中，17% 至 50% 的病变显示锯齿状腺体侵入黏膜下，表明为癌变。
11. 为了深入了解机制，对仅 BrafV600E、仅 Cdx2−/− 和 BrafV600E; Cdx2−/− 的结肠上皮进行 RNA 测序分析，发现后者中有几个途径被选择性富集，包括白细胞介素（IL）/STAT 和肿瘤坏死因子（TNF）/NF-κB 相关途径，这表明增强的炎症特征对肿瘤发生有强烈影响。

Inflammation-associated signaling

Para_01

1. 炎症是结直肠癌（CRC）发展的关键组成部分。
2. 炎症可能通过涉及端粒酶酶的反馈回路来调节肿瘤发生的潜在机制。
3. 由PRKCI编码的异型蛋白激酶C λ/I已被证明在慢性炎症性肠病（如克罗恩病和溃疡性结肠炎）的背景下调节炎症，这些疾病可能进展为侵袭性CRC。
4. 在炎症存在的情况下，Prkci的敲除不足以驱动结直肠肿瘤发生，除非与Apc缺陷相结合。
5. 一种可能的解释是，第二种异型蛋白激酶PKCζ（由PRKCZ编码）可能补偿Prkci的缺失，并诱导抑制肿瘤的通路，从而减轻肿瘤的起始和进展。
6. 为了验证这一点，生成了肠道特异性复合敲除Prkci和Prkcz（Vil-Cre;Prkcifl/fl; Prkczfl/fl）的小鼠，其小肠和结肠组织呈现出类似人类锯齿状表型的‘锯齿状’外观，细胞形态学特征类似人类富含杯状细胞或微泡锯齿状增生。
7. 此外，在Vil-Cre;Prkcifl/fl; Prkczfl/fl小鼠中，小肠和结肠均发展出SSA/P，这在Vil-Cre;Prkcifl/fl或Vil-Cre;Prkczfl/fl单独中未观察到，且这些病变随时间进展为肿瘤。
8. 16只小鼠中有13只（81%）在结肠中发展出肿瘤，这些肿瘤在近端侧富集，与人类锯齿状CRC的行为一致。
9. 这些肿瘤为MSS，未观察到参与DNA修复的基因表达变化（即错配修复能力），且为CIMP阴性。
10. Vil-Cre;Prkcifl/fl;Prkczfl/fl的SSA/P和腺癌病变未显示β-连环蛋白的核积累，对Vil-Cre;Prkcifl/fl;Prkczfl/fl肿瘤的转录组数据进行的富集分析揭示了MEK、EGFR和RAS基因特征的阳性富集。

Para_02

1. Vil-Cre;Prkcifl/fl; Prkczfl/fl肿瘤显示出广泛的CD45+细胞浸润，表明与肿瘤发生相关的强烈免疫反应。
2. CD45+细胞强烈表达程序性死亡配体1（PD-L1），Foxp3+调节性T细胞显著增加，CD11b+髓系细胞积累，包括Ly6ChiLy6G−单核细胞和Ly6C+Ly6G+多形核细胞，这表明存在髓系衍生抑制细胞。
3. 此外，Prkci和Prkcz的复合缺失导致CD8+T细胞浸润减少，这些细胞毒性T细胞被排除在肿瘤的SSA/P和腺癌区域之外。
4. CD8+T细胞有限的 presence 可以通过Vil-Cre;Prkcifl/fl; Prkczfl/fl中干扰素信号通路相关基因表达的减少来解释，这主要是由于与野生型对照相比Prkcz的缺失。
5. 这些观察结果表明，Prkci和Prkcz的双重缺失导致免疫抑制性肿瘤微环境。
6. 与其肿瘤抑制角色一致，肠道中Prkci的缺失，结合葡聚糖硫酸钠/偶氮甲烷处理，导致肿瘤较小，干扰素信号增强，CD8 T细胞招募增加，与基础Prkci表达的小鼠相比。
7. 一系列生化实验揭示，Pkcλ/I与ULK2相互作用，ULK2是一种磷酸化TBK1的激酶，以激活环状GMP-AMP合成酶（cGAS）和干扰素基因刺激因子（STING）通路及干扰素信号。
8. Pkcλ/I-ULK2相互作用通过诱导泛素-溶酶体降解来减少后者的活性，从而降低ULK2的稳定性和丰度。
9. 因此，Prkci的缺失具有促进肿瘤发生和免疫监视的双重作用，这可能被视为免疫调节治疗策略的考虑因素。

Notch signaling and metastasis

Notch信号通路与转移

Para_03

1. 锯齿状CRC可以被归类为CMS4分子亚型，其特征是间质细胞表型[例如，TGF-β信号激活，癌症相关成纤维细胞（CAF）丰富，上皮-间质转化（EMT），血管生成，固有免疫细胞激活]以及KRAS突变的富集。
2. Notch信号通路与炎症和CRC有关，可以通过来自肿瘤细胞、内皮细胞或固有免疫细胞的配体激活。
3. 高NOTCH评分与CMS4亚型和不良预后相关，且高比例的CRC转移表现出Notch细胞内域的强染色。
4. 开发了几种包含Vil-CreERT2; Apcfl/+; KrasG12D; Trp53fl/fl; Rosa26N1icd/+等基因的小鼠模型，以研究KRAS突变如何与Notch信号通路协同在体内驱动CRC。
5. 肿瘤发生率在Apcfl/+; Trp53fl/fl (AP)、Apcfl/+; Trp53fl/fl; Rosa26N1icd/+ (APN)、KrasG12D; Trp53fl/fl (KP)和KrasG12D; Trp53fl/fl; Rosa26N1icd/+ (KPN)之间相似。
6. 相比之下，Trp53fl/fl; Rosa26N1icd/+ (PN)小鼠发展出的肿瘤具有延长的潜伏期。
7. 在组织学上，KPN肿瘤表现出锯齿状形态，而Apc缺失的肿瘤显示管状形态，且KPN肿瘤保留了MLH1表达，这表明这些肿瘤代表具有MSS表型的锯齿状肠道肿瘤。

Para_04

1. 从KPN和APN肿瘤及类器官中获得的基因表达特征显示，KPN特征预测结果较差。
2. 此外，在KPN肿瘤中观察到中性粒细胞浸润特征。
3. 通过趋化因子分析以识别中性粒细胞吸引介质，发现Cxcl5在肿瘤上皮细胞中表达，中性粒细胞中Cxcr2表达增加。
4. 在KPN小鼠中，通过药理学阻断CXCR2受体或耗尽中性粒细胞，显著减少了转移，但不影响原发肿瘤负担。
5. 令人好奇的是，这些治疗并未显著改善生存率，引发了中性粒细胞相关转移在KPN小鼠死亡中贡献程度的问题。
6. 此外，Tgfb2在KPN类器官中表达上调，TGFB2表达与CMS4、NOTCH评分、KPN/KP特征及锯齿型在人类CRC数据集中相关。
7. 使用ALK5抑制剂抑制TGF-β信号通路，减少了这些病变中的转移负担和中性粒细胞浸润。
8. 此外，ALK5或CXCR2抑制增加了转移病变中细胞毒性CD8 T细胞的丰度，表明减少中性粒细胞丰度和增加抗肿瘤CD4和CD8细胞可能驱动抗转移效应。

The gut microbiome in serrated CRC development

Para_01

1. CRC风险因素与局部生态系统的组成和功能变化有关，该系统包括细菌、真菌、古菌和病毒，统称为微生物组。
2. 锯齿状病变通常表现出多种粘蛋白的表达增加，这会产生一个粘液帽，可能维持微生物群[66]。
3. 此外，识别特定菌株的富集和/或耗竭可能有助于研究微生物群如何与遗传打击协同驱动锯齿状CRC。

Para_02

1. 细菌生物膜在89%的右侧正常组织和结直肠癌组织中检测到，而左侧肿瘤中仅为12%。
2. 这些侵袭性微生物生物膜的存在与上皮通透性增加、IL6-STAT3激活升高以及隐窝上皮细胞增殖增强相关。
3. 额外的研究对传统型（左侧富集）和锯齿型（右侧富集）结直肠癌之间的微生物组进行了更深入的分析。
4. 对540名接受结肠镜检查的个体（323名对照，144名传统型，40名HP，33名SSL）的传统腺瘤和锯齿状病变的16S rDNA测序观察到，SSL中Erysipelotrichia显著减少，与对照组相比。
5. 然而，在伊朗和韩国队列进行的独立研究并未发现正常对照、HP和SSL之间的微生物组组成有任何显著差异，这可能是由于样本量较小。

Para_03

1. 为了更全面地注释传统息肉和锯齿状息肉之间的微生物组，共收集了140名个体（50名无息肉者，45名管状腺瘤，33名锯齿状腺瘤，12名未知病理）的1883个样本，采用了多种采样方法，包括黏膜刷和吸液、灌洗吸液以及粪便样本。
2. 采样方法（例如，从结肠黏膜与粪便）被发现可以解释10-15%的微生物组变异。
3. 在个体水平上，健康肠道组织和息肉之间的黏膜刷检未发现微生物组组成有显著差异。
4. 然而，来自管状腺瘤和锯齿状息肉的黏膜吸液彼此之间以及与无息肉个体之间存在显著差异，可以解释1-4%的微生物组变异。
5. 重要的是，基于微生物组特征开发的分类器模型能够准确预测息肉类型（即管状与锯齿状），这表明不同息肉类型之间存在显著的微生物组差异。

Para_04

1. 尽管微生物组与不同CRC肿瘤类型之间存在广泛的关联，但关于微生物组在锯齿状CRC发展中的功能证据却很稀少。
2. 一项研究发现，Prkci基因敲除的肠上皮细胞处于炎症状态，并且微生物组谱发生了改变，其中变形菌门的丰度增加，而厚壁菌门的丰度减少。
3. 此外，与Apcfl/+肿瘤相比，Apcfl/+; PrkciKO小鼠的肠道肿瘤表现出炎症细胞因子的显著增加，而使用广谱抗生素鸡尾酒治疗的Apcfl/+; PrkciKO小鼠，其肿瘤数量显著减少，仅与Apcfl/+相比。
4. 因此，这些发现表明炎症与微生态在Apcfl/+; PrkciKO驱动的肠道和结肠肿瘤发展中存在相互作用。
5. 另外，BrafV600E; Alk5fl/fl小鼠显示出黏膜屏障的完整性受损，这可能使上皮细胞暴露于肠道微生物群和有毒代谢物，从而触发炎症。
6. 事实上，广谱抗生素治疗也显著减少了右侧肿瘤小鼠的肿瘤负担并延长了其生存期。
7. 对抗生素和安慰剂处理的BrafV600E; Alk5fl/fl组织进行RNA测序分析显示，炎症和免疫反应相关通路减少。
8. 有趣的是，与安慰剂对照组相比，抗生素治疗后胎儿样基因程序的表达也减少。
9. 总的来说，这些发现表明炎症和肠道微生态是驱动BrafV600E; Alk5fl/fl或Prkci和Prkcz基因敲除驱动的锯齿状肿瘤发生的关键特征。

Para_05

1. 几种细菌菌株已被证实与结直肠癌的发生有关，例如表达聚酮合酶的大肠杆菌、产肠毒素的脆弱拟杆菌（ETBF）和具核梭杆菌。
2. ETBF定植导致BrafV600E; Lgr5Cre（BL）小鼠发生结肠炎，而长期ETBF定植则导致脾脏和肝脏炎症增加，尽管没有肿瘤形成。
3. 在16周龄以内，ApcΔ716-Min或BrafV600E; Lgr5Cre; ApcΔ716（BLM）小鼠的肿瘤发生通常较为罕见，且仅限于远端结肠。
4. ETBF定植6至13周导致Min小鼠远端结肠肿瘤形成，而BLM小鼠则在近中端和远端结肠出现肿瘤，长期ETBF定植使BLM小鼠的中位肿瘤负担是Min小鼠的两倍。
5. 值得注意的是，近中端肿瘤仅见于BrafV600E小鼠，而KrasG12D; Lgr5Cre, Min小鼠仅出现远端结肠肿瘤，类似于仅Min小鼠。
6. 全基因组CpG岛甲基化分析显示，与假暴露的两种基因型相比，ETBF定植的ApcΔ716-Min或BLM小鼠的DNA甲基化显著增加。
7. 然而，与ApcΔ716-Min肿瘤+ETBF及其相应的假对照组相比，ETBF诱导的BLM肿瘤表现出更高的CpG岛甲基化。
8. 对ApcMin和BLM假上皮进行的RNA测序分析显示，BLM上皮富集了参与干扰素信号传导的基因，而ETBF诱导的BLM肿瘤与ETBF + ApcΔ716-Min肿瘤相比，富集了与T辅助1型和IL12/Stat4信号传导相关的基因集。
9. 总的来说，这些发现表明病原菌定植与遗传背景协同作用，调节结直肠肿瘤的表观遗传和基因表达状态，以及肿瘤位置。
10. 与ETBF诱导的BLM肿瘤中免疫细胞迁移和信号传导增强一致，抗PD-L1治疗显著降低了肿瘤负担，与同型治疗对照组相比。
11. 相比之下，ETBF + ApcΔ716-Min小鼠在接受抗PD-L1或同型对照治疗后的肿瘤数量没有显著差异。
12. 综合来看，这些发现支持进一步研究病原微生物群如何与宿主肠道遗传学协同作用，驱动锯齿状结直肠癌及其对免疫检查点阻断的潜在反应。

Concluding remarks and future perspectives

Para_01

1. 我们预计，之前讨论的第一波研究将有助于指导后续体外和体内模型的发展，这些模型将提供对疾病生物学的机制性见解。
2. 然而，仍存在一些挑战和局限性（见未解决的问题）。
3. 具体而言，与锯齿状结直肠癌的起始和进展相关的细胞起源和基因-环境相互作用仍知之甚少。
4. 我们强调了未来需要研究的领域，以获得对疾病生物学的基本见解，并识别新的治疗途径（图4）。

• 图4. 锯齿状结直肠癌（CRC）的起始和进展模型。

Para_01

1. 化生是指将一种常驻的分化细胞替换为另一种在该组织中不存在的分化细胞类型。
2. 一个常见的例子是肠化生，它可以在几种组织中发生，包括食道、胃或胰腺，作为对损伤的反应。
3. 化生是修复过程的一部分，但如果未解决，它可能会促进肿瘤发生。
4. 对传统锯齿状息肉的多组学分析识别出一种胃化生基因特征（例如，MUC5AC、AQP5、TFF2和MSLN），在后者中富集。
5. 此外，锯齿状腺瘤表现出降低的干细胞评分，这导致作者提出这些病变是以"自上而下"的方式发生的，而不是与传统的结直肠癌/腺瘤发展相关的"自下而上"干细胞驱动模型。
6. 肠道隐窝中的Lgr5+群体已被证明是肠道癌的起源细胞。
7. 推测，"自上而下"模型会暗示非干细胞/祖细胞（即LGR5阴性）是锯齿状腺瘤起始的起源细胞。
8. 起源细胞是什么，以及在这种非干细胞群体中选择的后续（表观）遗传改变是什么？
9. 这个问题需要一个深思熟虑的方法，因为起源细胞很可能是由多种因素共同作用产生的，包括潜在的突变，以及外部信号如炎症和局部微环境，如基质细胞和微生物组。
10. 此外，肿瘤部位（例如，近端与远端）和交界区，如回盲交界处，可能具有不同的转化倾向和不同的起源细胞。

Para_02

1. 常用的Vil-Cre模型靶向大多数排列在隐窝-绒毛轴上的细胞，这可能限制了理解锯齿状CRC起源细胞的能力。
2. Mist1-Cre系靶向结肠隐窝基底外的细胞类型（例如，杯状/肠内分泌细胞），已被证明会促进近端结肠的肿瘤发展。
3. 生成其他靶向隐窝-基底轴上特定细胞类型的Cre系，并结合细胞谱系追踪研究，可能会阐明锯齿状CRC的细胞起源。
4. 因此，探索在人类锯齿状腺瘤中观察到的胃化生是否为疾病发展的必要条件或早期组织损伤的后果将非常重要。
5. 识别驱动胃化生的关键转录节点并生成基因工程小鼠类器官（例如，BrafV600E + Cdx2−/−）中这些因素的敲除将对于解决这一问题至关重要。
6. 这些类器官可以随后进行原位移植并监测肿瘤发生，也可用于深入的分子分析。
7. 另外，可以生成报告基因的初级细胞系和类器官，用于全基因组筛选，以识别这些系统中的胃化生调节因子。

Para_03

1. 尽管传统和锯齿状息肉已被分析[78]，但尚不清楚所识别的菌株是否与进展为侵袭性锯齿状结直肠癌相关。
2. 因此，一项系统性的、纵向的临床研究，追踪健康个体和患有锯齿状病变（无论是否进展为侵袭性癌症）个体的肠道微生物组的演变，可能对早期检测和微生物组补充具有潜在的临床转化意义。
3. 一旦确定了与疾病进展相关的特定菌株，可以将它们与患者或小鼠来源的锯齿状肿瘤类器官进行共培养，以进行组织学、DNA测序和RNA测序分析，从而阐明宿主肿瘤与微生物组相互作用的分子程序。
4. 或者，可以将携带致癌等位基因的基因工程小鼠置于无菌环境中，并用在锯齿状结直肠癌中耗尽或富集的菌株进行处理，并监测肿瘤发展。
5. 可以 perform 深度分析，如单细胞和空间转录组分析，以评估肿瘤与环境之间的相互作用[79]。

Para_04

1. 锯齿状结直肠癌患者的治疗策略和方案相对于传统结直肠癌来说定义较少。
2. 一些已被提议用于治疗靶向的领域包括血管生成信号通路、免疫检查点抑制剂，以及阻断侵袭前沿的FASCN蛋白。
3. 然而，需要随机临床试验来评估这些药物的有效性和患者在治疗期间及治疗后的预后。
4. 锯齿状结直肠癌可能表现出特定特征，例如间质参与（例如，硬化性），这可能具有治疗可行性。
5. Vil-Cre;Prkcifl/fl; Prkczfl/fl模型产生的锯齿状肿瘤伴有硬化和与CMS4和iCMS3间质结直肠癌相似的分子特征。
6. 使用聚乙二醇化透明质酸酶（PEGPH）治疗导致体内肿瘤负担减少，单细胞分析显示治疗和未治疗肿瘤之间的成纤维细胞组成发生了显著变化。
7. 此外，PEGPH治疗使肿瘤对免疫检查点阻断敏感，并减少了肝转移灶。
8. 另外，MMR缺陷是锯齿状结直肠癌的常见特征。
9. 在这方面，一项针对伴有dMMR肿瘤的直肠癌患者进行的小型新辅助研究表明，抗PD-L1治疗具有优异的疗效，这可以在临床环境中探索锯齿状结直肠癌的治疗。
10. 总的来说，这些例子强调了建模锯齿状结直肠癌异质特征的重要性，目标是更好地理解疾病生物学并识别潜在的治疗途径。

Outstanding questions

1. 锯齿状结直肠癌的（表观）遗传进化景观是什么？
2. 与不同锯齿状病变（即， sessile serrated, goblet cell rich, microvesicular hyperpolyps）相关的肿瘤微环境是什么？这在疾病进展过程中如何变化？
3. 哪些生物标志物可以作为分子替代物来识别锯齿状病变？
4. 我们能否识别遗传启动子来开发转基因Cre系，以便更有效地靶向锯齿状结直肠癌主要发展的近端结肠中的遗传重组？
5. 为什么一些基因工程小鼠模型表现出CIMP、MSI和Wnt信号通路激活，而其他模型则不表现？
6. 在MSI/CIMP锯齿状肿瘤中可以靶向哪些治疗脆弱性？这些病变对DNA损伤剂、免疫疗法和/或表观遗传调节剂敏感吗？