YYDS的跑WB成功经验总结——磷酸化蛋白（3）

1.、关于洗脱 一定要注意，膜一定要完全泡在洗脱液中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，让膜受热均匀。这一点很重要，要不然压出来的总蛋白、内标会不均一，无法进行比较，影响我们的结果分析。 洗脱液是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。实验发现水浴有时温度不稳定，温度定为55 ℃时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除。建议温度设为50℃，30 min，既能有效去除已结合的抗体，又比55 ℃更能保护蛋白。 抗体洗脱液配方：取0.5mol/L的Tris-Hcl（pH=6.8）25ml、4g SDS和1.4ml β-巯基乙醇，加纯水定容至200mL。

2、 磷酸化抗体选择 区分非磷酸化的抗体和磷酸化的抗体 一般原则是非磷酸化的抗体既可以识别非磷酸化的蛋白，也可以识别磷酸化的蛋白。磷酸化的抗体只能识别磷酸化的蛋白，而不能识别非磷酸化的蛋白。当然由于抗体识别表位的原因，不排除有些非磷酸化的抗体只能识别非磷酸化的蛋白，不能识别磷酸化的蛋白。 选择对应的磷酸化位点的抗体 如IkBα的主要磷酸化位点包括S32、S36和Y42。因此在选择磷酸化抗体之前，一定要先查阅文献在你的实验条件下或者预测目的蛋白是发生哪种位点的磷酸化，或者根据磷酸激酶来判断可能的磷酸化位点。 磷酸化抗体的说明书一定要仔细看 并最好根据厂商的操作说明来操作实验，这是实验成功的保证。因为不同的磷酸化抗体公司推荐的操作步骤不同。比如CST的一些抗体是脱脂奶粉封闭，一抗、二抗用BSA配制。 最最重要的是，抗体质量一定要好，特异性强，效价高；同时是经过验证，发表过文章的抗体，这样结果自然容易很多。

3、总蛋白和内参对照都要做 ① 磷酸化蛋白检测需要设置两个内参 一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白 比如你要检测Akt磷酸化，那你就要同时跑一个Akt的蛋白和Akt磷酸化的抗体，仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的变化不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明磷酸化水平发生变化了。 另一个是普通内参比如actin和GAPDH等 普通内参是作为体系的对照，保证上样量一致从而排除体系本身的影响。