罕见病，检出率却高达 3.87%？这种高致死率的疾病检验需注意什么

在海南某医院进行的脊髓性肌萎缩症（SMA）筛查公益活动中，共筛查 723 人次，筛出 26 例 SMA 致病基因携带者，2 例疑为 SMA 患者，检出率高达 3.87%！

SMA 是一种罕见的神经肌肉遗传疾病，其发病率低，约为 1/10,000，在成人中更加罕见，因此也更容易被误诊漏诊。然而，与低发病率形成鲜明对比的是，SMA 致病基因人群携带率高达 1/50，我国携带者约为 3,000 万人^[1]。SMA 是由致病基因 SMN1 的功能缺失引起，95% 的 SMA 患者是因为遗传了来自父母双方的 7 号外显子缺失的 SMN1 基因。如果父母双方同为 SMA 致病基因的携带者，会有 25% 的概率生育出 SMA 患儿。患儿常在出生后 6 个月内起病，预后差，多数患儿在 2 岁内死于呼吸衰竭，该疾病位于儿童致死性遗传病第一位。

致病基因检测的目标人群及常用检测方法

对于 SMA，致病基因的检测是确诊该病的金标准。近年来，因该病携带率高，预后差，治疗手段有限且成本巨大。相关指南及共识建议开展该病的三级预防：筛选 SMA 致病基因携带的育龄未孕女性、孕期筛查 SMA 受累胎儿及对 SMA 患儿尽早确诊，以期改善预后^[1-3]。

SMA 一级预防：通过婚前/孕前目标人群进行 SMA 相关的科普教育、开展携带者筛查，从而减少和消除 SMA 缺陷患儿出生风险的系列预防措施。

SMA 二级预防：通过筛查孕早中期胎儿 SMN1 基因进行产前诊断，及早发现 SMN1 基因致病性变异，并进行干预。

SMA 三级预防：在新生儿至儿童阶段进行 SMA 疾病早期的筛查和干预，争取更佳的临床结局。

其中，对目标人群做好致病基因的精准检测，是做好该病的三级预防的核心环节。在检测过程中，为了提高准确性，检测人员不仅应熟知不同检测技术的特点，还应该对样本提取和检测操作规范严格把关。目前，SMN1 基因检测常用检测方法及特点可总结如下表。

表 1 SMN1 基因检测常用检测方法总结表^[4-5]

除上述常用检测技术之外，其他不常规使用的检测技术还包括 Sanger 测序、二代测序技术（NGS）、双侧双重等位基因特异性 PCR（AS-PCR）、聚合酶链反应-变性高效液相色谱（PCR-DHPLC）等。

对比上述几种检测技术，PCR-RFLP 虽简单易行，但可能遗漏携带复合杂合突变的患儿，而该部分患儿占比高达 5%～10%。而 MLPA 虽然是国内外管理共识推荐使用诊断 SMA 的金标准，但该方法操作繁琐，需要一代测序仪，设备成本高，且目前没有 NMPA 审批的试剂盒。相比之下，定量 PCR（qPCR）法具有准确性高、稳定性好等特点。目前，该方法已有 NMPA 审批的商品化 SMN1 基因缺失检测试剂盒，避免了程序优化及试剂选择中可能引入的结果差异，成为临床上 SMA 诊断的主要辅助手段^[6]。

近年来，部分技术如 PCR-熔解曲线法基于荧光定量 PCR 方法，并对其做了进一步改良，结合了竞争性 PCR、饱和荧光染料、熔解曲线分析技术及归一化软件处理技术，用于 DNA 样本中 SMN1 基因的拷贝数检测，它不但具备上述荧光定量 PCR 方法的优点，也拥有更高的高灵敏度及特异度，且相关的检测试剂盒也广泛应用于临床。

然而，需要强调的是，可靠的检测结果除了受检测手段本身的特点的影响外，还依赖检测流程中的规范操作和检测产品质量把控。

PCR-熔解曲线法检测流程、使用方法与注意事项

目前，PCR-熔解曲线检测致病基因 SMN1 依赖于成熟的基因检测试剂盒来完成，为了确保检测准确性，在实操过程中的检测流程实操及注意事项如下（以天隆科技 SMA 试剂盒为例）：

图 1 PCR-熔解曲线法检测流程图 

①标本采集：常用的标本包括乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血（2～5 mL）。

※ 注意：全血样本在 2℃～8℃ 条件下保存时间不超过 4 天，-20℃ 或以下条件可保存 12 个月，避免反复冻融，全血样本运输时采用冰袋冷藏运输，总运输时间不超过 3 天；

②核酸提取：建议使用核酸提取仪及配套试剂进行自动化核酸提取，并按照说明书规范进行核酸提取，样本加载和上机提取过程也需按照仪器和试剂说明书要求进行（如图 2 所示）。

图 2 样本加载和上机提取流程图

※ 注意：全血样本勿吸取凝血块或粘稠状液体；吸取洗脱产物时如果观察到有粘稠液或明显磁珠残留，可采用高速离心后取上清液检测；样本提取 DNA 需用紫外分光光度计测定浓度，DNA 质量符合相关要求（浓度：10～120 ng/μL，纯度（OD260/OD280）：1.7～2.0）。

③ PCR 扩增及荧光检测

试剂配制及分装：按照说明书配置 SMN1 基因 PCR 反应混合液；

体系建立：分装后的各 PCR 反应混合液中分别对应加入 0 拷贝质控品、单拷贝质控品和 2 拷贝质控品及待测基因组，盖紧 PCR 反应管并瞬时离心；

PCR 扩增及荧光检测：将 PCR 反应管转移至实时荧光 PCR 仪样本孔，按照下表放置并设置样本，主要阶段包括预变性（循环 1 次）、扩增（循环 10 次）、扩增（循环 25 次）、熔解曲线（循环 1 次）和冷却（循环 1 次）。

④ 数据分析及结果判断

※ 注意：数据读取前首先进行检测有效性评估，主要包括：① 质控，即评估 0 拷贝质控品和单拷贝质控品熔解曲线峰及 R 值；② 样品有效性，即评估样品浓度、纯度、△Tm 值及扩增曲线。在确定检测有效性后进行结果判定：若 SMN1 基因检测 7 号及 8 号外显子检测均为 2 拷贝及以上（R ≥ 0.74），则未发现 SMN1 基因缺失，若检测为 0 拷贝（P = 0）或单拷贝（R ≤ 0.70），则考虑为 SMN1 纯合缺失/杂合缺失，若 0.70 < R < 0.74，建议重新取样进行检测，或使用其他检测技术进行检测。

⑤ 试验后处理：包括废弃物、样本以及试剂材料处理、紫外消毒等。

由于检测结果直接指导临床实践，检测过程中的质控非常关键，在应用 SMN1 检测试剂盒时，我们也应当关注试剂产品质控是否达到了相关要求，以天隆科技生产质控为例，具体有以下几方面：

质量管理：试剂生产采用科学的质量管理方法，包括统计过程控制、测量系统分析等，以确保检测过程持续可控。试剂在已通过 ISO 9001、ISO 及 TUV 13485 质量体系考核的 GMP 车间生产，严格执行三检要求，即自检、互检、专检。

参考品：所用试剂盒是否设有真实样本配制的参考品（阴性参考品、阳性参考品、精密度参考品、检测限参考品等），以确保产品安全有效的同时，更加符合临床真实检验场景；检测限参考品包含：0 拷贝、单拷贝、两拷贝，有效保证产品检测的灵敏度，并准确识别纯和缺失和杂合缺失。

目前，SMA 致病基因 SMN1 检测已被多项共识推荐用于该病的诊断及三级预防。其中，qPCR 检测技术因多项优点成为 SMA 诊断的主要辅助手段，此技术及基于此的改良技术研发的检测试剂盒已广泛应用于临床。在检测过程中，应熟悉检测流程同时做好质控，以保证检测的灵敏度及准确度。

✩ 本文仅供医疗卫生等专业人士参考

参考文献

[1] 北京医学会罕见病分会,北京医学会医学遗传学分会,北京医学会神经病学分会神经肌肉病学组,等. 脊髓性肌萎缩症多学科管理专家共识[J]. 中华医学杂志,2019,99(19):1460-1467.

[2] 中国研究型医院学会神经科学专业委员会,中国出生缺陷干预救助基金会神经与肌肉疾病防控专项基金组织专家组. 脊髓性肌萎缩症新生儿筛查专家共识（2023版）[J]. 中华医学杂志,2023,103(27):2075-2081.

[3] 北京医学会医学遗传学分会,北京罕见病诊疗与保障学会. 脊髓性肌萎缩症遗传学诊断专家共识[J]. 中华医学杂志,2020,100(40):3130-3140.

[4] 北京医学会医学遗传学分会,北京罕见病诊疗与保障学会. 脊髓性肌萎缩症遗传学诊断专家共识[J]. 中华医学杂志,2020,100(40):3130-3140.

[5] 张晓青,王丽丽,余永国,等. 脊髓性肌萎缩症的三种基因诊断方法比较[J]. 中华检验医学杂志,2015,38(1):16-20.

[6] 李耀华.qPCR法检测脊髓性肌萎缩症基因的质控点初探[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):714-718.