动物切片免疫荧光染色图片怎么分析？

我希望获得免疫荧光的图片，再做一个半定量分析，看到有的教程说用ImageJ软件处理，但在实际处理中遇到几个小问题。

1.我是送公司做了动物切片免疫荧光染色，返还的是dat文件，一般会用caseviwer这个软件打开扫描的图片，如果从这个软件里截图保存tif格式图片再到imageJ里分析，我是不是从头到尾都不能调整图片的荧光强度呢？在caseviwer里能调吗？因为感觉荧光有点暗。

2.做半定量分析每个组会有误差棒，是每个组选三张切片，每张切片挑选一个区域截图来分析吗？

3.我看到有的视频里说在imageJ里不能调整图片的阈值，因为会影响后面荧光强度的分析，是所有组的图片都默认自动值，都不用调整吗？

4.我的切片是肠管，有的肠管是展开的，有的是卷曲折叠的，我想如果用总荧光强度/面积来计算的话，那相同面积下肠道有皱褶地方的平均荧光强度就会高，这是人为造成的干扰，但我的样本较少，肠管都展开的没有几个，这该怎么办？

希望路过的同道解答一下，谢谢！