CGP肝癌 | 血清聚腺苷二磷酸核糖聚合酶2作为潜在的肝细胞癌诊断标志物的研究
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作为肝脏最常见的原发性恶性肿瘤［1］，我国HCC发病病例占全球新发肝癌病例的45.3%［2］。近年来HCC治疗的效果并未获得显著的提高，其主要原因是HCC发病隐匿，早期诊断仍存在困难［3］，提高早期诊断手段对于及时治疗和提高HCC生存率至关重要［4］。因此完善早期诊断手段，尤其是针对传统生物标志物灵敏度不足的缺陷，开发新的用于HCC早期筛查的生物标志物可能是提高诊断及预后的重要方法。
甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是HCC诊断中的经典血清标志物，其特异度尚可，但灵敏度较低［5］。大部分HCC患者的病程全程中AFP的表达水平普遍不高（本研究中将AFP <20 μg/L的HCC患者定义为AFP阴性的HCC患者［6］），导致此类患者容易被漏诊。因此，临床上迫切需要有效的分子生物标志物用于HCC的早期诊断［7］，尤其是针对AFP阴性的患者。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶2［poly（ADP-ribose）polymerase-2，PARP2］作为PARP家族的一员，是参与DNA损伤修复的重要蛋白修饰酶，并且参与调控细胞生长、增殖和凋亡等基本生命过程［8］。PARP2在DNA修复和基因组稳定性维护中起重要作用，而DNA损伤是导致HCC等肿瘤疾病发生和发展的一个重要因素。在携带BRCA1/2基因突变的乳腺癌和卵巢癌［9］，PARP家族作为癌症治疗靶点被广泛研究［10-11］。然而，PARP2在HCC中的表达及诊断价值的研究仍然值得进一步探索，其是否能识别AFP阴性的HCC患者尚且未知。
本研究拟通过检测HCC患者及健康体检者的血清标本中PARP2蛋白水平，分析PARP2在HCC患者中的表达以及相关临床特征的关系，旨在探讨血清PARP2在HCC中的临床意义和诊断效能，尤其是血清PARP2蛋白水平用于AFP阴性的HCC患者的早期识别诊断。
1 资料与方法
1.1 病例血清标本及纳入排除标准
收集2021年3月—2022年7月新疆医科大学第一附属医院新发HCC患者的血清样本38例，HCC患者血清标本均采集于治疗前；收集HCC患者临床病理特征资料，包括性别、年龄、肿瘤大小（最大直径）和数量、TNM分期、淋巴转移、远处转移、AFP值和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）等信息以供下游分析。纳入标准：HCC患者经病理组织学和影像学资料明确诊断为HCC，并且符合《原发性肝癌病理诊断实践指南（2015年版）》［12］中原发性HCC诊断标准；术前未行HCC相关治疗；临床病历资料完整。排除标准：既往有恶性肿瘤病史，自身免疫性疾病及血液系统疾病。
选取新疆医科大学第一附属医院同期进行健康体检的38例体检健康者血清作为对照组。纳入标准：无重大病史，且体检结果均正常。本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理审批（伦理审批号：K202107-15）。
1.2 生物信息学分析PARP2表达与HCC恶性进展的联系
基于TCGA数据库（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）中mRNA表达谱文件（50例健康体检者与371例HCC患者），分析PARP2 mRNA在泛癌中的表达，初步探究其作为肿瘤标志物的合理性；分析PARP2在HCC配对样本和非配对样本中的差异表达，明确PARP2在肿瘤组织和正常组织中的表达差异，通过PARP2表达量绘制HCC诊断的受试者工作特征（ROC）曲线，分析诊断效能、灵敏度及特异度等关键指标。
1.3 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测HCC细胞HepG2和正常肝细胞系WRL68的PARP2基因表达
Trizol法提取正常肝细胞系WRL68细胞（新疆大学李金耀团队赠送）和肝细胞癌细胞系HepG2细胞（购买自普诺赛公司）总RNA，Nano Drop1000紫外分光光度仪测定RNA浓度，使用TAKARA逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，RT-PCR检测GAPDH、PARP2 mRNA表达水平，PCR仪扩增反应条件按说明书操作，用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。
1.4 Western blotting检测HCC细胞HepG2和正常肝细胞系WRL68的PARP2蛋白表达水平
HepG2和WRL68分别培养于6 cm培养皿（DMEM细胞培养基+10%胎牛血清+1%双抗，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养），待细胞状态稳定后用无菌PBS将细胞洗两遍，加入含有蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液，在冰上裂解15 min，用细胞刮将细胞刮下来转移至Ep管中，静置15 min，12 000 r/min 4 ℃离心15 min，转移上清，BCA法对提取的总蛋白进行定量后，加入上样缓冲液在100 ℃煮蛋白10 min。将蛋白上样于制备好的SDS-PAGE胶，电泳完成后电转至PVDF膜，经5%脱脂奶粉封闭后，分别加入稀释后的一抗溶液，GAPDH（1∶5 000），PARP2（1∶2 000），在4 ℃冰箱孵育过夜。次日经TBST洗膜3次，加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000）室温孵育1 h后，加入ECL化学发光底物试剂盒进行显影拍照。使用Image J软件对条带灰度值进行统计分析。
1.5 血清PARP2蛋白的ELISA检测
38例HCC患者血清及38例健康体检者血清采用ELISA方法，检测血清PARP2蛋白水平。人PARP2 ELISA试剂盒购于武汉菲恩生物科技有限公司，货号EH2530；具体操作按照试剂盒操作说明书进行。
1.6 确定诊断界值
采用ROC曲线分析血清PARP2蛋白对HCC的预测价值，在检测值的约登指数最大时，判定诊断HCC的截断值。
1.7 统计学方法
统计分析应用SPSS 21.0软件进行。符合正态分布的计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用Wilcoxon符号秩和检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析。分析及评估诊断效能采用ROC曲线分析法，获得ROC曲线下面积（AUC）。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基于TCGA数据库分析PARP2 mRNA在HCC患者癌和癌旁组织中的表达
基于TCGA数据库分析发现：癌旁组织PARP2 mRNA表达量为（2.28±0.34），低于癌组织PARP2 mRNA表达量（3.44±0.63），差异有统计学意义（t=-12.85，P<0.001）。通过PARP2表达量绘制TCGA数据库中50例健康体检者与371例HCC患者诊断的ROC曲线，AUC为0.952 3，灵敏度为74.93%，特异度为98.00%，见图1。
2.2 HCC细胞和正常肝细胞中检测PARP2 mRNA表达水平和蛋白表达水平
检测正常肝细胞WRL68及HCC细胞HepG2中PARP2 mRNA表达水平，结果发现，在HepG2细胞中PARP2 mRNA表达量为（3.35±0.91），高于WRL68细胞中PARP2 mRNA 表达（1.00±0.61），差异有统计学意义（t=-3.70，P<0.05）。
检测HCC细胞系HepG2正常肝细胞系WRL68的PARP2蛋白表达水平，结果发现，HepG2细胞中PARP2蛋白表达（5.25±0.55），明显高于正常肝细胞WRL68（0.67±0.24），差异有统计学意义（t=-15.27，P<0.001），见图2。
2.3 检测HCC患者血清中的PARP2蛋白水平
HCC患者血清PARP2表达量为33.22（19.21，53.77）μg/L，高于健康体检者血清PARP2表达量11.01（7.26，15.09）μg/L，差异有统计学意义（Z=-6.244，P<0.001）。
2.4 血清PARP2与HCC临床病理特征的关系
不同性别、年龄、TNM分期、远处转移、HBsAg、肿瘤大小、AFP水平者血清PARP2表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；不同淋巴转移、肿瘤数目者血清PARP2表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.5 血清PARP2表达水平用于HCC诊断的效能分析及联合诊断
绘制PARP2表达量预测HCC的ROC曲线，AUC=0.92（95%CI=0.85~0.98），灵敏度为76.32%，特异度为97.37%，最佳截断值为19.45 μg/L。
HCC患者血清PARP2表达量与AFP水平不存在相关性（rs=-0.210 6，P>0.05）。经血清AFP检测，38例HCC患者中21例为AFP阴性HCC（AFP <20 μg/L）。
绘制PARP2表达量预测21例AFP阴性HCC和38例健康体检者的ROC曲线，结果显示，血清PARP2蛋白水平区分AFP阴性HCC和健康人的AUC为0.95（95%CI=0.88~1.00），灵敏度为85.71%，特异度为97.37%，最佳截断值为19.59 μg/L。
绘制AFP表达量诊断HCC的ROC曲线，AUC为0.80（95%CI=0.70~0.91），灵敏度为60.53%，特异度为97.37%，最佳截断值为8.145 μg/L。上述结果表明，PARP2与AFP相比具有更佳的灵敏度，尤其是针对AFP阴性的HCC患者。进一步评估PARP2联用AFP的诊断效能，使用“并联”的联合诊断模式，发现：联合诊断的灵敏度为92.11%，特异度为94.74%，AUC为0.934 2（95%CI=0.869 4~0.999 0）；针对AFP阴性的HCC患者，联合诊断的灵敏度为85.71%，特异度为94.74%，AUC为0.902 3（95%CI=0.804 9~0.999 6），见图3。
3 讨论
HCC发病隐匿，需提高早期诊断手段，研发诊断HCC的新型生物标志物，特别是针对AFP阴性的HCC患者，对HCC的及时诊断治疗具有重要意义［13］。本研究基于TCGA大数据分析发现PARP2在HCC癌组织中显著上调，在细胞水平中进一步验证了这一结果；在本地样本中，HCC患者血清PARP2蛋白水平高于健康人血清，血清PARP2可以用于诊断AFP阴性HCC患者，PARP2和AFP联合诊断HCC，诊断效能更佳。表明血清PARP2在HCC的诊断中可以发挥生物标志物的作用。
在实际的临床诊疗工作中，血清检查常扮演针对高危人群进行大规模初筛的角色，因此肿瘤标志物需要有极高的灵敏度，为发现更多的疑似患者以供进一步明确筛查［14］。血清AFP是全世界最广泛使用的HCC肿瘤标志物，但AFP诊断HCC的灵敏度约为60%，存在大量漏诊的可能，迫切需要更高灵敏度的生物标志物，尤其是针对AFP不增高的HCC患者［15］。目前临床上常见的HCC肿瘤标志物除AFP之外，主要有脱-γ-羧基凝血酶原（DCP）、高尔基体蛋白73（GP73）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）、AFP异构体AFP-L3等。有研究报道DCP诊断HCC的灵敏度为62.50%，特异度为85.50%［16］，与本研究中PARP2的灵敏度和特异度相比较低。GPC3会在其他类型的肿瘤中表达，如脂肪肉瘤和肺鳞状细胞癌等［17］。虽然上述肿瘤标志物作为诊断HCC的生物标志物，但其均不能满足临床诊断HCC的诊断需求［5］。而本研究中发现的PARP2用于筛查HCC患者的灵敏度为76.32%，较GPC3及DCP等肿瘤标志物的灵敏度高，提示血清PARP2在HCC中具有较好的诊断效能。血清PARP2在筛查AFP阴性的HCC患者中灵敏度为85.71%，与AFP联用能更大幅度提高灵敏度，提示血清PARP2在AFP阴性HCC患者中也具有较好的诊断效能。本研究中HCC患者血清PARP2蛋白水平与淋巴转移和肿瘤数目等临床指标相关，表明PARP2在HCC患者的预后评估中具有一定潜在价值［18］。提示血清PARP2可以作为潜在的HCC诊断及判断预后的指标。
PARP2是PARP蛋白家族的成员，该家族包括17个参与多种细胞过程的成员，PARP2可能在许多细胞过程中发挥核心作用，包括DNA修复、复制和转录［19］。DNA修复缺陷是癌症的常见特征［20］。已有文献报道PARP2在BRCA 1/2纯缺失的乳腺癌和卵巢癌中高表达，强调PARP2是一种新的潜在治疗靶点［21］，而HCC血清中PARP2蛋白水平表达目前尚未见相关报道。肿瘤疾病的发生与DNA损伤积累有关，所以DNA损伤修复机制是靶向治疗癌症的突破口［22］。PARP家族在DNA损伤修复和转录调控中发挥重要作用，PARP1和PARP2是最早被发现的，是重要的DNA损伤分子感受器。当DNA发生断裂时，PARP2被激活，DNA缺口可以被PARPs有效地ADP核糖基化，以对抗DNA损伤的细胞［23］。本研究基于TCGA数据库和细胞水平分析PARP2在HCC中的表达量，PARP2在HCC中显著上调，HCC患者血清PARP2蛋白水平高于健康体检者这一结果，推测其与癌症组织内形成的过氧化物使DNA出现断裂损伤，出现肿瘤细胞复制现象，进而激活PARP2，使PARP2表达量上升有关［24］。
本研究的局限性：（1）本研究仅在HCC中探究了血清PARP2的蛋白表达水平，尚未评估血清PARP2在其他良性肝病如乙型肝炎、肝硬化及肝血管瘤等肝病中的表达。（2）本研究样本量较小，仍需扩大样本量去验证本研究结论。
综上所述，血清PARP2可作为筛查HCC患者的生物标志物，尤其是在AFP阴性的HCC患者中，同时与AFP联用可提高诊断HCC的灵敏度。
参考文献略
最后编辑于 2024-08-20 · 浏览 1507
