YYDS的WB成功经验——磷酸化蛋白（1）

1、样品制备重点

① 先弄清楚样品中磷酸化蛋白表达情况

可以利用 PhosphoSitePlus 数据库查询蛋白的磷酸化情况。PhosphoSitePlus当中关于翻译后修饰的信息主要来自于具体的实验结果以及高通量测序的预测，包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等。可以查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。 样品的磷酸化水平表达一般都非常低，有些甚至不表达，这个时候可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，刺激条件各不相同，刺激的时间和强度需要自己查文献和进行预实验来确定，要确保这个样品本身能检测出目的蛋白。 注意，刺激并越多越好，要做到充分但不过分（如磷酸化IRS1，仅需刺激5min，刺激过久会进入负反馈机制进而开始降解），正确刺激会帮助我们得到最佳实验结果。 有合适的阳性对照至关重要，在任何实验中，我们都应考虑包含适当的阳性和阴性对照，可以进一步确定抗体检测到的特异性信号。 如CST官网就有详细的刺激方法和阳性对照：(图二）

② 磷酸化蛋白样品提取&保存

取样要快、准、冷 蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，磷酸化蛋白在室温条件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以取样品的过程要迅速，样品要新鲜（新鲜的样品制备提取物背景较低）。 样品处理最好在全程冰上操作，操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4 ℃预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温的状态。 抑制磷酸酶的干扰 提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鲜配制，现配现用。 裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，因为组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，否则即使条带压出来也会很浅，结果也不可信（okadaic acid，NaF磷酸酶抑制剂）。 外源性的磷酸酶主要是由实验过程中的其它试剂带入的，比如要确保实验试剂中不含磷酸酶等；此外，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以另一个关键是要尽量使用无菌清洁的试剂和凝胶，必要时加入防腐剂。 弄清检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸 如果是酪氨酸还要加1µmol/L的 Na3VO4（原钒酸钠）。有些磷酸化抗体会注明上样前不要煮沸，煮沸可能会破坏其磷酸化位点。