CGP肝癌 | 基于网络药理学方法探析汉黄芩素治疗肝细胞癌作用机制和体外实验研究
肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的大多数，是世界上许多地区癌症相关死亡的主要原因［1］。多数亚洲国家、美国和欧盟批准Sorafenib和lenvatinib为HCC的一线治疗药物［2］。在过去的20年，学者研究了HCC的临床管理，显著改善了治疗方案，其中包括新的药物组合。尽管已经取得了较大进展，但HCC的总体治疗结果仍不能令人满意［3］。所以对新的HCC治疗方法进行探索研究具有重要意义。
药物治疗是癌症治疗的重要方法［4-5］。在药物研发的过程中，临床前研究的先导化合物筛选起着至关重要的作用［6-7］。药用植物能产生许多具有药理活性的代谢产物，是药物研发中先导化合物的重要资源［8］。但是传统的先导化合物筛选方法周期长，工作量大并且价格昂贵［9-10］，网络药理学的发展，为从药用植物的有效成分中筛选先导化合物开辟了新的途径［11］。
汉黄芩素（wogonin）是一种黄酮类天然化合物，是黄芩属植物的主要活性成分［12］。既往研究表明汉黄芩素具有良好的抗肿瘤活性［13］。本研究旨在通过网络药理学方法分析汉黄芩素治疗HCC的作用机制，并通过体外实验进行验证，期望为HCC新的治疗选择进行探索。
1 材料与方法
1.1 汉黄芩素AMDE及毒性预测
在Pubchem数据库（ https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）中收集汉黄芩素的SMILES式，将检索到的SMILES分别导入SWISS AMDE在线服务网站（ http://www.swissadme.ch/ ）分析汉黄芩素的吸收、分布、代谢、排泄（AMDE）特性及生物利用度。导入ProTox-Ⅱ-Prediction of TOXicity of Chemicals在线服务网站（ https://tox-new.charite.de/protox_II/index.php?site=compound_input ）预测汉黄芩素的肝毒性、致癌性、致突变性、免疫毒性、细胞毒性。
1.2 汉黄芩素及HCC靶点收集
在TCMSP数据库（ https://tcmsp-e.com/tcmsp.php ）中检索“wogonin”，收集汉黄芩素药物靶点。以关键词“hepatocellular carcinoma”在TTD（ https://db.idrblab.net/ttd/ ）、GenCards（ https://www.genecards.org/ ）、OMIM（ https://www.omim.org/ ）、DisGnet（ https://www.disgenet.org/ ）数据库中检索并收集HCC疾病靶点。将药物靶点与疾病靶点取交集，获得药物干预疾病的潜在靶点。
1.3 蛋白互作网络构建和核心靶点筛选
将药物干预疾病潜在靶点导入STRING数据库（ https://cn.string-db.org/ ），选择物种为“Homo sapiens”，设置required score为“highest confidence（0.900）”构建蛋白互作网络。将蛋白互作网络导入Cytoscape 3.9.0软件（隐藏连接度为0的节点），并使用“Cytohubba”插件筛选出前10位的基因，然后使用GIEPA数据库（ http://gepia2.cancer-pku.cn/#index ）分析核心基因在HCC组织和正常肝组织中mRNA表达水平（|logFC|>1和P<0.05表示基因有显著差异）以及核心基因与HCC患者生存预后的关联（Log-rank P<0.05视为有统计学差异）。
1.4 GO和KEGG富集分析
在R软件中使用“clusterProfiler”包进行GO和KEGG富集分析，P<0.01视为具有显著性。利用“ggplot2”包对分析结果进行可视化。
1.5 分子对接
在PDB数据库（ https://www.rcsb.org/ ）中下载核心基因的蛋白三维结构，并在Pymol软件中完成移除水分子和小分子配体。在Pubchem数据库中下载汉黄芩素的化合物3D结构，使用Chem3D软件将能量最小化。最后使用Autodock vina进行分子对接并在pymol中将对接结果可视化。
1.6 细胞培养
人肝癌细胞株HepG2（中乔新舟）和人正常细胞株LO2（中乔新舟）完全培养基条件为MEM（含NEAA）培养基90%+胎牛血清（FBS）10%。培养条件为5% CO2、37 ℃。
1.7 CCK-8试剂盒测定细胞活性
将细胞按1×104个/孔接种于96细胞培养板中，在5% CO2、37 ℃培养条件下过夜。移除培养基，每孔加入100 μL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，重复2次。每孔加入200 μL含汉黄芩素浓度分别为0、18.5、37.5、75.0、150.0、300.0 μmol/L的完全培养基，分别处理24、48、72 h。移除培养基，每孔加入100 μL PBS洗涤2次。将CCK-8试剂（普诺恩）按10%溶解于完全培养基中，每孔加入100 μL。在5% CO2、37 ℃条件下孵育2 h。在酶标仪450 nm波长下检测吸光度（OD值）。
1.8 平板克隆形成实验
HepG2细胞按500个/孔接种于6孔细胞培养板中，5% CO2、37 ℃条件下孵育过夜。移除培养基，加入2 mL PBS洗涤2次。加入含汉黄芩素浓度分别为0、37.5、75.0、150.0 μmol/L的完全培养基，孵育48 h后，移除培养基，加入2 mL PBS洗涤2次。加入完全培养基，3 d换液1次，连续培养14 d。移除培养基，加入2 mL PBS洗涤2次，加入多聚甲醛固定25~30 min，使用结晶紫染色，拍照。
1.9 划痕实验
HepG2细胞按5×105个/孔接种于6孔板中，培养至细胞完全融合后，使用无菌100 μL移液器枪头划伤层细胞，加入2 mL PBS洗涤2次，加入含汉黄芩素浓度分别为0、37.5、75.0、150.0 μmol/L的无血清培养基，分别在0 h和48 h对划痕进行拍照，使用Image J软件进行分析。细胞迁移率为划痕恢复距离相对于原始距离。
1.10 细胞凋亡
HepG2细胞按2×105个/孔接种于24孔板中，加入含汉黄芩素浓度分别为0、37.5、75.0、150.0 μmol/L的完全培养基进行处理24 h，使用Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡。在荧光显微镜下对加入Annexin V-FITC试剂的细胞进行拍照，绿色荧光信号越强，代表细胞凋亡越多。
1.11 蛋白质免疫印迹
加入含汉黄芩素浓度分别为0、37.5、75.0、150.0 μmol/L的完全培养基处理HepG2细胞48 h。使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液分离总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。10% SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，然后，将膜与一抗4 ℃孵育过夜。再次与IgG偶联二抗在室温下孵育2 h。最后，用ELC检测蛋白条带。
1.12 统计学方法
数据以（x±s）表示（所有实验重复3次）。采用GraphPad Prism软件进行分析和作图。多组间比较采用单因素方差分析（ ANOVA ）。两组间比较采用成组t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 汉黄芩素AMDE及毒性预测结果
SWISS AMDE和ProTox-Ⅱ-Prediction of TOXicity of Chemicals在线服务网站对汉黄芩素分析结果显示，分子式：C16H12O5，分子量（MW）：284.26，可旋转键：2，氢键受体：5，氢键供体：2，脂水分配系数：0.77，生物利用度较高。肝毒性、致癌性、致突变性、免疫毒性、细胞毒性均为无活性的。
2.2 汉黄芩素及HCC靶点
在TCMSP数据库中收集到汉黄芩素靶点135个，在TTD、GeneCards、OMIM、DisGenet数据库中收集到HCC靶点8 238个。将化合物与疾病交集靶点113个作为汉黄芩素干预HCC的潜在靶点。
2.3 汉黄芩素干预HCC潜在靶点蛋白互作网络构建及核心靶点筛选
将化合物与疾病交集靶点导入STRING数据库，得到92个节点（隐藏连接度为0的节点），265条边的蛋白互作网络（图1）。使用Cytoscape软件中的“Cytohubba”插件的“MCC”算法获得前10位的核心靶点，分别为原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、热休克蛋白HSP90-α（HSP90AA1）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、细胞周期蛋白依赖性激酶1 （CDK1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、G1/S-特异性周期蛋白-D1（CCND1）、转录因子Jun（JUN）、RELA原癌基因（RELA）、一氧化氮合酶（NOS2）及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（CDKN1A）（图2）。在GEIPA数据中基于TCGA数据库中的数据对核心基因在HCC患者及正常肝组织中mRNA表达水平（图3）进行分析发现：CDK1和SRC在HCC组织中表达水平高于正常肝组织（P<0.05）。CDK1、HSP90AA1、RELA、SRC、JUN在HCC患者中高表达与不良预后相关（P<0.05）（图4）。
2.4 GO和KEGG富集分析
GO富集（图5A）分析显示，交集基因主要富集的生物学过程（BP）有抗氧化反应（response to oxidative stress），细胞对化学应激的响应（cellular response to chemical stress），对辐射的响应（response to radiation）等，富集的细胞组分（CC）有膜筏（membrane raft），膜微结构域（membrane microdomain）等，分子功能主要富集在蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、胆酸结合作用（bile acid binding）等。KEGG通路富集（图5B）分析中交集基因主要富集的通路有PI3K/AKT信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、白介素（IL）-17信号通路（IL-17 signaling pathway）等。
2.5 分子对接
将核心靶点CDK1和SRC的三维蛋白质结构与汉黄芩素化合物三维结构使用Autodock vina进行分子对接，结果显示CDK1、SRC与汉黄芩素的结合能均低于-7 kcal/mol，证明蛋白质与化合物结合构型活性较强（图6）。
2.6 汉黄芩素抑制HCC细胞增殖
使用CCK-8试剂盒检测汉黄芩素对HCC细胞增殖影响发现，24、48、72 h时，各组HepG2细胞活性比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。在相同浓度和时间梯度下，HepG2细胞活性低于LO2细胞活性，差异有统计学意义（P<0.05），见表2~4。平板克隆形成实验结果显示，各组HepG2细胞克隆形成数比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图7、表5。
2.7 汉黄芩素抑制HCC细胞迁移和诱导HCC细胞凋亡
划痕实验结果表明，各组HepG2细胞迁移率比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图8、表5。HepG2细胞在一定浓度的汉黄芩素的处理后，使用Annexin V-FITC试剂盒在荧光显微镜下观察发现，随着汉黄芩素的浓度升高，绿色荧光信号增强，说明细胞凋亡数量增加（图9）。
2.8 汉黄芩素抑制核心靶点CDK1、SRC表达和减弱PI3K/AKT信号通路
Western-blotting（WB）实验结果表明，一定浓度范围内，汉黄芩素能够下调核心靶点CDK1和SRC的表达水平。PI3K、P-AKT蛋白表达下调，总AKT蛋白表达无影响，表明汉黄芩素能够减弱PI3K/AKT信号通路（图10，表6）。
3 讨论
汉黄芩素的AMDE特性经过分析，符合小分子化合物类药规则-利平斯基五规则［14］。并且毒性预测结果显示无肝毒性、致癌性、致突变性、细胞毒性、免疫毒性，具有开发为药物的潜力。通过对汉黄芩素干预HCC的前10位的核心靶点进行分析后，既往研究表明，AKT1缺失能够阻止小鼠肿瘤的形成［15］。CCND1沉默能够抑制HCC干细胞的分化［16-17］。TP53突变导致免疫应答下调与HCC预后相关［18-20］。通过沉默CDKN1A能够促进HCC的增殖和迁移［21-22］。CDK1在HCC中高表达并且与不良预后相关，下调CDK1的表达，能够抑制HCC细胞的增殖、迁移和诱导凋亡［23-25］。SRC高表达促进HCC的进展，抑制SRC的表达，HCC细胞的增殖受到明显的抑制［26-28］。KEGG富集分析结果中，IL-17信号通路能促进HCC的进展，通过影响IL-17信号通路能抑制HCC细胞的增殖［29-30］。通过靶向p53信号通路能够调控HCC的发生和进展［31-32］。PI3K/AKT信号通路与细胞的增殖、迁移、凋亡等方面相关，在癌症中被异常激活，与肿瘤的发生和进展有关，靶向PI3K/AKT信号通路是癌症治疗的有效策略［33-34］。在网络药理学分析中发现CDK1、SRC两个核心靶点的mRNA表达水平在HCC组织显著高于正常肝组织，并且在HCC患者中，CDK1、SRC的高表达与不良生存预后相关。PI3K/AKT信号通路富集到的基因数量最多。
体外实验证明，一定浓度范围内的汉黄芩素能够抑制人肝癌细胞株HepG2的增殖能力，并且在一定浓度范围内对人正常肝细胞株LO2的增殖抑制能力小于癌细胞，说明汉黄芩素对HCC细胞的抑制能力具有特异性。划痕实验和凋亡实验表明，汉黄芩素能够抑制HCC细胞的迁移和诱导HCC细胞凋亡。通过WB实验结果发现，汉黄芩素处理HepG2细胞后，核心靶点CDK1、SRC的表达量降低，PI3K/AKT信号通路信号减弱。
结合体外实验和既往文献研究，汉黄芩素可能为通过抑制核心基因CDK1、SRC的表达和减弱PI3K/AKT通路信号，然后抑制HCC细胞增殖、迁移和诱导细胞凋亡，达到干预HCC发生和进展的目的。结合网络药理学分析以及体外实验结果，证明汉黄芩素是一个具有潜力开发为HCC治疗药物的天然化合物，本研究对汉黄芩素治疗HCC的作用机制进行了初步探索，为汉黄芩素的后期开发利用提供了一定的参考。
局限性：本研究仅对在mRNA表达水平在HCC组织与正常肝组织有显著差异并且与不良生存预后相关的核心基因进行体外实验验证，未对其他核心基因进行深入研究分析。由于实验条件的限制，未能进行体外实验进一步研究汉黄芩素对HCC发生和进展的干预作用。
参考文献略
最后编辑于 2024-08-16 · 浏览 1401
