定量乙酰化蛋白质组学分析揭示SIRT3介导HSP60去乙酰化抑制结核分枝杆菌胞内存活

作者：朱传智，段玉衡，董静，贾红彦，张蓝月，邢爱英，李自慧，杜博平，孙琦，黄银霞，张宗德，潘丽萍 

第一作者及单位：朱传智，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所/耐药结核病研究北京市重点实验室/分子生物学实验室

通信作者及单位：潘丽萍，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所/耐药结核病研究北京市重点实验室/分子生物学实验室

Quantitative analysis of the lysine acetylome reveals the role of SIRT3-mediated HSP60 deacetylation in suppressing intracellular Mycobacterium tuberculosis survival

Zhu C, Duan Y, Dong J, Jia H, Zhang L, Xing A, Li Z, Du B, Sun Q, Huang Y, Zhang Z, Pan L.

Microbiol Spectr, 2024 Jun 25:e0074924.

doi: 10.1128/spectrum.00749-24.

PMID: 38916288.  

01

背景

近年来，蛋白质翻译后修饰（如磷酸化、泛素化、乙酰化等）在调节巨噬细胞抗结核免疫反应中起着关键作用。在蛋白质翻译后修饰中，乙酰化是最早被发现的一种修饰，然而，由于前期质谱技术和抗体技术有限，直到近10年有关蛋白质乙酰化修饰的研究才得以深入开展。已有研究表明，蛋白质乙酰化修饰在蛋白稳定性、蛋白折叠和蛋白质-蛋白质相互作用中发挥着关键作用，能显著影响基因表达调控、细胞分裂、细胞骨架重排、染色质重塑、新陈代谢和信号转导等生物功能进程。我们前期已综述了结核分枝杆菌感染诱导宿主蛋白质乙酰化修饰，以及结核分枝杆菌乙酰转移酶介导宿主蛋白质乙酰化进而调控宿主抗结核免疫中的作用。然而，对于结核分枝杆菌感染巨噬细胞诱导宿主蛋白质乙酰化的全景图谱，以及哪些重要蛋白质乙酰化修饰参与到调控宿主抗结核免疫应答中仍不清楚。因此，通过乙酰化蛋白质组学技术揭示结核分枝杆菌感染诱导宿主蛋白质乙酰化差异图谱，阐释宿主-病原体相互作用之间的复杂相互作用，可以为免疫调节和结核病发病机制的潜在机制获得有价值的见解。

02

方法

通过串联质谱标签（TMT）标记的定量乙酰化蛋白质组学技术分析了结核分枝杆菌感染巨噬细胞（24 h）诱导蛋白质乙酰化修饰水平的变化；进而通过生物信息学聚类方法分析了差异乙酰化蛋白的生物功能和信号通路；并运用免疫共沉淀和免疫印迹方法验证差异显著的乙酰化蛋白表达和乙酰化修饰水平。通过针对乙酰化差异明显的蛋白（HSP60），运用点突变技术构建了模拟HSP60乙酰化和去乙酰化状态的突变体，利用慢病毒过表达不同乙酰化状态的HSP60后，通过菌落形成单位（CFU）、免疫印迹和免疫共沉淀方法分析HSP60关键乙酰化修饰位点突变对于巨噬细胞清除结核分枝杆菌功能的影响。最后，利用免疫共沉淀方法验证去乙酰化酶激动剂、抑制剂处理、HSP60关键乙酰化位点的突变对于组蛋白去乙酰化酶SIRT3与HSP60间相互作用的影响，以及对巨噬细胞清除胞内结核分枝杆菌功能的影响。

03

结果

定量乙酰化蛋白质组技术共鉴定到巨噬细胞中的715个乙酰化肽段，其中包括544个赖氨酸乙酰化位点，主要分布在402个蛋白质内。与未感染组比较，有74个蛋白质中的87个乙酰化肽段在结核分枝杆菌感染后显著上调，有53个蛋白质中的59个乙酰化肽段在结核分枝杆菌感染后显著下调。上述差异乙酰化蛋白的生物进程聚类主要富集于“信号传导”“细胞通讯”和“调节细胞生物合成过程”等；分子功能聚类主要为“蛋白质结合”“细胞粘附分子结合”和“钙粘蛋白结合”等；信号通路聚类主要为信号传导和代谢途径，包括“代谢途径”“糖酵解/葡萄糖新生”和“碳代谢”等。免疫共沉淀和免疫印迹分析结果显示，结核分枝杆菌感染可显著诱导HSP60表达，但其乙酰化修饰显著降低；并且质谱鉴定结果发现，结核分枝杆菌感染显著介导HSP60 K96去乙酰化。STRING数据库在线预测分析结果发现，结核分枝杆菌感染诱导HSP60、LDHA和 ATP5B乙酰化下调可能与去乙酰化酶SIRT3的相互作用有关。CFU结果显示，siRNA敲低HSP60可显著促进巨噬细胞清除胞内结核分枝杆菌；同时，过表达HSP60 K96去乙酰化突变能增强巨噬细胞对胞内结核分枝杆菌的杀伤作用，促进结核分枝杆菌感染巨噬细胞诱导的Caspase-3活化并介导细胞凋亡。结核分枝杆菌感染过程中，运用SIRT3激动剂和抑制剂处理可显著改变HSP60乙酰化修饰，并调节SIRT3与HSP60相互作用；然而，在HSP60敲低的巨噬细胞中，SIRT3激动剂和抑制剂处理后不影响巨噬细胞对胞内结核分枝杆菌的清除作用。最后，免疫共沉淀结果显示，HSP60 K96突变后，HSP60与SIRT3相互作用被显著抑制。

04

结论

本研究通过定量乙酰化蛋白质组学首次绘制了结核分枝杆菌感染巨噬细胞诱导的蛋白质差异乙酰化图谱；进一步揭示了结核分枝杆菌感染过程中组蛋白去乙酰化酶SIRT3与HSP60的相互作用及关键位点，并发现SIRT3介导HSP60 K96去乙酰化可显著促进Caspase-3活化诱导巨噬细胞凋亡，进而抑制结核分枝杆菌胞内存活。

本文来自于“中国防痨杂志期刊社”公众号