求助大肠杆菌his标签蛋白提取相关问题

目前所遇问题：蛋白浓度过低，只有不到1ml 1.02mg/ml，1管0.72，其他均低于0.2

实验步骤：

第一天晚上接菌复苏

37º培养至第二天下午五点，挑单菌落于5ml加了抗性的培养基试管，摇床37º180rpm，过夜培养

第三天一早，1：50扩大至500ml抗性培养基中，震荡培养3h，OD值0.912，加800uIPTG，震荡培养5h，收样，PBS重悬，-20冷冻保存

第四天早上高压破碎，600压力15min

离心取上清，蛋白纯化柱过柱，结果浓度很低

想问问我可能是哪里出了问题

等待答复ing