microRNA系列 （一）基本知识介绍

大家好，又和大家见面了。从本期开始，我们将为大家详细介绍近年来生物信息的研究热点之一，也是我们公司当前的关注重点——非编码RNA。虽然现在已经发现的非编码RNA种类有很多，但了解最深，也是大家公认最为重要的非编码RNA仍然是microRNA、long noncoding RNA和circular RNA这几类。这期我们就从最早发现的miRNA开始，陆续给大家介绍这方面的知识。

mircoRNA是什么？

    虽然microRNA (miRNA) 已经是生物学领域中研究的明星分子，甚至是有些“过气”的明星，但由于miRNA功能的广泛性和重要性，miRNA仍然在生物学研究中占据重要的一席之地，特别是在各种疾病研究中，增加miRNA相关的内容可以极大地提高研究的分量，提升论文档次。因此miRNA相关的分析也成为目前疾病组学及各种动植物组学分析的常规组成。

    miRNA是一类存在于真核多细胞生物中的小RNA分子，其发挥功能的成熟体部分序列部分很短，长度通常在24个核苷酸左右，最长不过30个核苷酸。成熟体miRNA的来源通常有两种，一种是从编码miRNA的“基因”转录而来，这些基因首先转录形成数百至数千nt的初级转录本（primary miRNA），随后初级转录本被切割加工为60-80nt左右的次级转录本（precursor miRNA），次级转录本包含一个“茎-环”结构，其环状部分被切割才成为成熟体miRNA，成熟体miRNA与相关的蛋白结合形成调控复合体。另一类miRNA的来源是各种mRNA分子，真核生物mRNA分子的内含子序列会有一部分会被切割加工，最终形成成熟体miRNA分子。 由于miRNA序列与其他RNA（包括mRNA或lncRNA等）存在碱基互补配对而发生相互作用，阻碍mRNA翻译或者降解mRNA，从而调节基因的表达（图1）。

图1.miRNA的生物发生过程

miRNA基因的特征

   miRNA基因有几个比较显著的特征，首先 miRNA 基因在染色体中存在单拷贝或多拷贝形式，而成簇存在的 miRNA 之间一般具有较高的相似性。其次，大部分 miRNA 在多个物种中通常保守。最后许多miRNA 的表达与发育阶段和组织相关，只在特定阶段与组织中表达，这一特性给通过实验方法寻找 miRNA 基因带来了一定难度。 为方便管理众多新发现的 miRNA， 研究人员为miRNA的命名制订了一系列规则，除最早发现的两个 miRNA：lin-4和let-7以外，所有miRNA 统一用 miR（大写 R）-后加数字表示。而用mir（小写 r）-后加数字表示 miRNA 基因。高度同源的miRNA 在其后加英文字母区别。多拷贝基因再后面加数字予以区别。

miRNA基因的识别鉴定

    在早期关于miRNA的研究中，研究人员多采用传统的定向克隆方法识别鉴定miRNA分子，但这种方法对很多低表达丰度的miRNA常常无法检测；此外，传统的分子克隆方法无法分辨miRNA分子与其他非编码RNA分子，如tRNA及rRNA的降解产物。而目前通过高通量测序方法搜寻miRNA正成为当前研究的常规手段。miRNA测序可以对样本中指定大小的所有miRNA分子进行并行测序，从而获得miRNA的表达量信息，并且可以发现未知miRNA，与传统方法相比，miRNA测序具有显著优势。

miRNA基因的数据库

    提到miRNA相关的研究，就不得不提大名鼎鼎的miRBase数据库（ http://www.mirbase.org/ ），miRBase是一个关于各物种已发现的miRNA的数据库，最早是由Sanger测序中心负责维护，目前已经转移至曼彻斯特大学。miRBase是关于miRNA基因最权威的数据库，所有重要物种的miRNA基因前体与成熟体序列都会有收录，而且数据可靠性很高，凡是与miRNA相关的研究几乎都会遇到这个数据库。2018年三月miRBase刚刚发布了第22版，里面包含了1982 条前体miRNA以及相应的2694条成熟体miRNA。

图2. miRBase数据库

 miRBase在实际使用过程中经常会遇到的一个问题是不同版本的miRNA ID不统一，同样一个miRNA在不同发布版中ID会有变化，特别是miRNA研究早期的命名，成熟体miRNA双链中表达水平较高的miRNA后面不加任何符号，而表达水平较低的miRNA会添加*号，而目前的命名规则统一用“-5p”和“-3p”分别命名，表明分别从miRNA前体的5’端臂和3’端臂加工而来。miRBase本身并没有提供不同版本间miRNA ID比较与转换功能。目前有一个很好用的第三方工具：miRBase Tracker( http://www.mirbasetracker.org/) 可以用来追踪miRNA ID的变迁，以及不同版本间的ID 转换。

图3. miRBase Tracker在线工具

    虽然miRBase是目前关于 miRNA使用最广泛的数据库，但它更偏重与人与动物基因组编码的miRNA，而植物基因组编码miRNA覆盖不是太广泛，所以研究植物miRNA可以使用另一个植物miRNA数据库PMRD ( http://bioinformatics.cau.edu.cn/PMRD/ ， 这个数据库是中国农业大学实验室负责维护，目前已合并并更新至植物非编码RNA数据库：PNRD)

图4. 植物miRNA数据库PMRD

miRNA靶基因数据库

对于miRNA而言，其中最重要的一个特征是对下游基因的调控，因此 miRNA下游靶基因的识别鉴定也是非常重要的工作。目前也有许多miRNA靶基因的数据库已经发布，包括实验验证及生物信息学方法预测的miRNA靶基因。其中最早建立的miRNA靶基因数据库为TarBase ( http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex/) ，该数据库收录经实验验证过的miRNA的靶基因，包括人、小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼等不同物种，目前已更新至8.0版。

图5. TarBase 数据库

     除TarBase之外，miRTarBase（ http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php ）也是一个重要的miRNA靶基因数据库， miRTarBase同样收录实验验证的miRNA靶基因数据，目前数据库已更新至7.0版，其中收录包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼在内的数十个物种的数十万miRNA-靶基因作用信息。

图6. miRTarBase 数据库

    除通过实验方法获得miRNA调控靶基因信息外，目前应用更为广泛的是通过各种生物信息学方法获取miRNA潜在的靶基因，其中应用比较广泛的 miRNA靶基因预测软件包括TargetScan, PITA, miRanda, RNAhybrid, RNA22等。各软件通常也会有不同物种预测的miRNA靶基因数据库发布，如最常用的TargetScan( http://www.targetscan.org/vert_71/) ，目前已更新至7.1 版，主要收录包括人，小鼠，果蝇，斑马鱼等不同物种在内的miRNA靶基因信息。

图7. TargetScan数据库

    除类似TargetScan这种单一软件预测结果数据库之外，目前实际使用更多的是对各种软件预测结果进行综合的数据库，而miRWalk（ http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/ ）是其中的佼佼者。miRWalk收录了目前最常用的十多种miRNA靶基因预测软件所获得的靶基因预测信息，并且同样收录了实验验证的miRNA靶基因信息，miRWalk 提供不同软件预测结果之间数据的整合功能，如数据取交集，并集等,使用户可以方便地获取感兴趣的信息。此外，miRWalk还提供了包括miRNA靶基因功能预测，参与信号通路富集分析能功能，可以说是miRNA研究的集大成者。目前miRWalk第三版已经发布。

图8. miRWalk数据库