有奖直播 | qPCR 实验流程及常见问题全解析

qPCR 可是科研人的必备技能，说起 qPCR 的实验经历，几乎人人都能吐槽两句。除了曲线杂乱无章，还有实验重复性差，对照设置错误等等……那么，出现这些问题的原因有哪些？如何解决？ 数据如何分析？

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一.常见问题解析

1. 熔解曲线出现杂峰：

1）杂峰在主峰之前，说明存在引物二聚体，建议需要重新设计引物。

2）杂峰在主峰之后，大多由非特异性扩增引起，建议调整稀释倍数、减少引物。 

2. 扩增曲线抖动，不光滑或没有平台期

可能因为仪器不准或模板不纯。建议进行仪器校准；增大模板稀释倍数。

3. 实验重复性差

1）样本问题：每次实验尽量保证样品部位、处理条件的一致性，确保提取核酸的纯度。

2）技术问题：通过定期校准加样器、配制预混合液、去除气泡等规范实验操作。

二.实验设计中的对照设置

完整的 qPCR 实验设计应包括实验组（处理样本）、阳性对照组（野生型或参考样本）、阴性对照组、空白对照组。

其中，空白对照，即未添加模板的 qPCR 体系，用来验证 qPCR 体系是否受到污染。阴性对照，即添加阴性模板的 qPCR 体系，用于排除实验操作导致的假阴性。

三.数据处理（相对定量法）

1.目的基因 Ct 值的归一化：

ΔCt（实验组）= Ct（实验组的目的基因）-Ct（实验组的内参基因）  

ΔCt（对照组）= Ct（对照组的目的基因）-Ct（对照组的内参基因）

2.实验组 ΔCt 的归一化：

ΔΔCt = 各样本的 ΔCt- 对照组的 ΔCt

3.表达水平的差异倍数：2 ^–ΔΔCt

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内容策划：潘成

内容审核：钟可可

题图来源：图虫创意