IF=11.4 一区！SUCLG1 限制 POLRMT 琥珀酰化以增强线粒体生物发生和白血病进展

本文分享的这篇文章刊登在The EMBO Journal（IF=11.4 一区）上，题为：“SUCLG1 restricts POLRMT succinylation to enhance mitochondrial biogenesis and leukemia progression. ”，这篇文章发现了👉琥珀酸辅酶 A 连接酶 SUCLG1 在癌症转录组中与线粒体基因的密切相关性🍾。

研究背景

线粒体是膜结合细胞器，在真核生物中充当动力源。与其他细胞器不同，线粒体拥有独特的基因组（mtDNA）来编码电子传递链（ETC）中的重要组成部分。mtDNA 存在于线粒体基质中，其中细胞器特异性转录复合物介导 mRNA 合成和基因表达。作为高度专业化能量生产的细胞器，线粒体将 mtDNA 转录与细胞代谢状态紧密耦合。然而，线粒体DNA功能代谢调节的机制仍不清楚。

线粒体转录复合物包含线粒体RNA聚合酶(POLRMT)和线粒体转录因子A和B2(TFAM和TFB2M)。TFAM和TFB2M促进POLRMT的转录起始位点和mtDNA结合的识别，使其能够介导mtDNA编码基因的转录。POLRMT 是 mtDNA 复制和转录的关键调节因子，因为它还合成线粒体基因组复制所需的 RNA 引物。先前的研究表明，线粒体转录复合物的活性与细胞代谢密切相关：

⏩（1）线粒体基因表达与营养供应和生物能量需求动态相关；

⏩（2）多种代谢酶的基因突变，如琥珀酸辅酶A连接酶α亚基(SUCLG1)、琥珀酸辅酶A连接酶[ADP形成]β亚基(SUCLA2)、胸苷激酶2(TK2)、脱氧鸟苷激酶(DGUOK) ，在临床上与线粒体DNA耗竭综合征（MDS）相关。值得注意的是，TK2 和 DGUOK 是公认的核苷酸代谢调节因子，并为 mtDNA 合成提供前体。相反，作为TCA循环酶的SUCLG1和SUCLA2在mtDNA复制和转录中的调节作用仍不清楚。因此，研究团队推测琥珀酸辅酶 A 连接酶可能将细胞代谢状态与线粒体 DNA 连接起来。

线粒体产生多种代谢中间产物，这些中间产物可以作为信号分子来调节线粒体生物发生（mitobiogenesis）。这些中间代谢物还可以作为翻译后修饰（PTM）的前体。蛋白质组学研究表明，线粒体复制和转录复合物以磷酸化、乙酰化和琥珀酰化的形式进行修饰。值得注意的是，琥珀酰化是一种 PTM，在此过程中琥珀酰基团与赖氨酸残基缀合。琥珀酰辅酶A提供琥珀酰基并化学修饰靶蛋白。此前，代谢酶的琥珀酰化已被证明可以调节不同癌症中的能量代谢和氧化还原平衡。蛋白质琥珀酰化在有丝分裂中的调节作用仍不清楚。

有丝分裂维持能量产生以支持细胞增殖和癌症发展。致癌突变重塑有丝分裂程序，促进癌症的发生和进展。对 TCGA 转录组进行了泛癌相关性分析，发现在线粒体代谢基因中，SUCLG1与 ETC 基因表达呈强烈正相关。从机制上讲，SUCLG1 限制 POLRMT 琥珀酰化以增强 mtDNA 转录，将琥珀酰辅酶 A 信号与有丝分裂联系起来。急性髓系白血病 (AML)，依赖于线粒体代谢，是由骨髓细胞中出现的一系列基因组突变驱动的。AML 衍生的FMS 样酪氨酸激酶 3 ( FLT3 ) 突变上调 SUCLG1，诱导 POLRMT 低琥珀酰化，从而增强线粒体生成和白血病进展。

研究结果

💡SUCLG1 维持 mtDNA 编码的基因表达和线粒体质量

为了确定哪些代谢酶可能调节线粒体DNA功能，在TCGA转录组研究中分析了线粒体代谢基因和ETC基因之间的相关性（图 1A）。根据 MitoCarta3.0（Rath 等人，2021），在涉及代谢的 405 个线粒体基因中，有 397 个基因与 TCGA Firehose 遗留数据集中 32 种不同癌症类型的 ETC 基因具有有效的 Spearman 相关性。ETC相关系数的泛癌排序显示，SUCLG1与各种癌症中的ETC基因表达密切相关（图 1A，B）。

SUCLG1将琥珀酰辅酶A转化为琥珀酸，这两种代谢物都是细胞代谢中重要的信号分子（图1）。采用 AML 作为模型，因为线粒体呼吸对于白血病的生长是不可或缺的。基因集富集分析显示，在三项独立的 AML 转录组研究中， SUCLG1与 ETC（也称为氧化磷酸化）呈正相关（图 EV1B）。TCGA AML 数据集中线粒体酶的排名表明，DGUOK为 mtDNA 合成提供了构建模块，显示出最显着的 ETC 相关性（图 EV1C）。这一观察结果支持了相关分析的稳健性。接下来探寻 SUCLG1 是否充当有丝分裂的正调节因子。

图1. SUCLG1 维持 mtDNA 编码的基因表达和线粒体质量

为了测试这一点，在人白血病细胞中稳定表达了两种不同的针对SUCLG1 的短发夹 RNA (shRNA) 。CD34 +脐带血（CB）细胞被包括作为正常对照（图 1C和EV1D）。MitoTracker Green (MTG) 是一种专门标记线粒体的荧光染料。正如预期的那样，耗尽SUCLG1显着降低了测试细胞的 mtDNA 丰度和 MTG 强度（图 1C和EV1D）。此外，损失SUCLG1降低源自结直肠癌（HCT116）、肺癌（A549）和肝癌（HepG2）的细胞系中的线粒体质量（图 1C和EV1D）。总的来说，SUCLG1 正向调节线粒体质量。

💡SUCLG1 与促进有丝分裂，白细胞的增殖和维持线粒体质量和呼吸有关

由于 SUCLG1 位于线粒体基质中，假设 SUCLG1 可能调节细胞器特异性的有丝分裂。支持这一观点的是， AML 细胞系（HL60 和 MV411）中SUCLG1的缺失降低了 mtDNA 编码基因的 mRNA 和蛋白表达（图 1D、E）。DNA 聚合酶γ亚基 (POLG)、POLRMT 和线粒体核糖体蛋白 L45 (MRPL45) 的表达，它们是 mtDNA 复制、转录和蛋白质翻译的关键调节因子，进行了最小程度的改变（图 1D，E）。此外，团队控制线粒体生物发生的核因子，包括过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅激活因子-1α（PGC-1-α）和核因子红细胞2相关因子2（NRF2）显示出轻微的变化（图1）。 1D，E）。

这些结果表明 SUCLG1 维持 mtDNA 编码的基因表达。为了验证 SUCLG1 在线粒体发生中的作用，团队进行了电子显微镜分析以量化 MV411 细胞中的线粒体。与之前的结果一致，SUCLG1敲除细胞中的线粒体数量减少了约 50%（图 1F，G）。研究团队进一步从稳定细胞中分离线粒体并测定ETC复合物的活性（图 EV1E）。SUCLG1的耗尽显着下调五种不同配合物的催化活性（图 1H）。这些数据共同支持 SUCLG1 维持有丝分裂。

图 EV1. SUCLG1 维持 mtDNA 编码的基因表达和线粒体质量

接下来测试了 SUCLG1 在白血病细胞中的代谢作用。在大多数 TCGA 癌症类型中， SUCLG1显示与其他 ETC 相关代谢基因呈正相关（图EV1F）。在 MV411 和 HL60 细胞中敲除SUCLG1后，两个排名最高的 ETC 相关基因PRDX5和TXN2显示 mRNA 表达降低（图 EV1G、H）。这些数据表明 ETC 相关基因可能协同作用来控制线粒体活性。接下来，团队重点关注 SUCLG1 进行详细的代谢分析。MV411 细胞的 CellROX Green 染色显示，耗尽SUCLG1后 ROS 水平增加（图 EV1I,J）。

相应地，在膜联蛋白V/7-氨基放线菌素（7-AAD）染色测定中， 在SUCLG1敲除细胞中观察到细胞凋亡增加（图EV1K，L）。此外，团队用低剂量的阿霉素处理 MV411 细胞以诱导衰老，如先前所述。SUCLG1的缺失不会导致 β-半乳糖苷酶染色的明显变化（图 EV1M）。在SUCLG1敲除细胞中，溴脱氧尿苷（BrdU）掺入显着减少，表明细胞增殖减少（图 EV1N）。细胞周期分析证明了SUCLG1-与乱序对照相比，耗尽的细胞增殖不太活跃（图 EV1O）。SUCLG1 共同支持白血病细胞的增殖。

人类先天性SUCLG1突变在临床上已与线粒体 DNA 耗竭综合征相关，但机制未知。疾病衍生的突变针对脯氨酸 170 (P170) 和丙氨酸 209 (A209)，它们是进化过程中高度保守的残基，并且紧邻 SUCLG1 的催化位点（图 EV1P-R）。团队构建了标记有疾病的 SUCLG1 突变体、P170R 和 A209E，测试其生物学影响。使用免疫纯化的 SUCLG1-Flag 蛋白进行的酶活性测定表明，与野生型酶相比，P170R 和 A209E 突变体表现出催化作用不足（图 EV1S）。此外，团队将SUCLG1 P170R和SUCLG1 A209E重新表达到SUCLG1敲除的MV411细胞中（图 1I）。SUCLG1突变体未能恢复mtDNA丰度、mtDNA编码基因表达和细胞呼吸（图 1I-L）。这些数据表明 SUCLG1 活性对于维持线粒体质量和呼吸至关重要。

💡SUCLG1 降低琥珀酰辅酶 A 水平以限制 POLRMT 琥珀酰化

接下来团队探索SUCLG1 如何调节细胞器特异性的生物发生。琥珀酸辅酶A连接酶是一种异二聚酶。SUCLG1与SUCLG2或SUCLA2结合，将琥珀酰辅酶A转化为琥珀酸，同时分别产生GTP或ATP(图 2A )。琥珀酰辅酶A通过氧化戊二酸脱氢酶(OGDH)衍生自α-酮戊二酸(α-KG)(图 2A )。与SUCLG1不同，SUCLG2、SUCLA2和OGDH均未与 TCGA 转录组中的 ETC 基因表达表现出一致的相关性（图 EV2A-C）。SUCLG1敲除细胞中 OGDH 的蛋白表达保持不变（图 EV2D）。

因此，团队专注于 SUCLG1 来研究新陈代谢如何与有丝分裂发生相关。团队推测 SUCLG1 可能通过控制特定代谢物的丰度来改变有丝分裂。代谢组分析表明， SUCLG1敲除的 MV411 细胞中糖酵解中间体增加（图 2B）。SUCLG1耗尽后，氨基酸也出现失调。引人注目的是，琥珀酰辅酶A（SucCoA）在SUCLG1缺陷细胞中积累（图 2B）。接下来团队探索癌细胞如何在缺乏SUCLG1的情况下在线粒体缺陷中存活下来。代谢流测定显示SUCLG1敲除细胞的基础糖酵解率增加（图1-2）。

图2 . SUCLG1 降低琥珀酰辅酶 A 水平以限制 POLRMT 琥珀酰化

 2C和EV2E，表明糖酵解可能会增强以补偿线粒体呼吸缺陷。支持这一观点的是， MV411 和 HL60 细胞中 SUCLG1耗尽后，葡萄糖消耗和乳酸生成均升高（图2D、E和EV2F、G）。细胞ATP的定量验证了SUCLG1耗尽的MV411和HL60细胞中的能量供应减少（图 2F和EV2H）。与葡萄糖摄取相反，在SUCLG1耗尽的MV411细胞中谷氨酰胺消耗轻微减少（图 2G）。因此，糖酵解在 S UCLG1-中上调缺陷细胞应对线粒体功能障碍并维持细胞生存。

💡在SUCLG1敲除细胞中，琥珀酰辅酶A水平下降，而SLC13A5表达增加，可能通过补充外源琥珀酸来抵消其减少

接下来团队监测了SUCLG1敲除和拯救细胞的代谢变化。在SUCLG1敲除细胞中，α-KG和琥珀酰辅酶A升高伴随着ATP和GTP水平降低（图 2H）。野生型SUCLG1（而非其催化缺陷型突变体）的重新表达恢复了琥珀酰辅酶A丰度（图 2H）。值得注意的是，琥珀酸并没有显着减少。团队测试了与琥珀酸代谢和运输相关的基因的mRNA表达（图 EV2I）。SLC13A5（一种细胞膜结合转运蛋白）在敲除SUCLG1后表现出表达增加（图 2I）。其他琥珀酸转运蛋白仅表现出 mRNA 表达的适度变化。因此，SLC13A5可以导入外源琥珀酸来补偿SUCLG1敲除细胞中琥珀酸产量的减少。琥珀酰辅酶A以区室化的方式存在于线粒体中。团队进一步分离线粒体来量化琥珀酰辅酶A，其以与细胞琥珀酰辅酶A类似的模式改变（图 2J和EV2J）。因此，SUCLG1 抑制线粒体琥珀酰辅酶 A，这可能有助于其调节线粒体发生的作用。

图 EV2. SUCLG1 降低琥珀酰辅酶 A 水平以限制 POLRMT 琥珀酰化

琥珀酰辅酶A作为琥珀酰供体在琥珀酰化反应中修饰底物蛋白。团队推测 SUCLG1 可能会修饰蛋白质琥珀酰化。细胞内代谢物的分布具有高度异质性。代谢酶已被证明可以改变代谢物水平并有效调节其相互作用蛋白质的活性。为了确定 SUCLG1 的潜在靶标，团队分析了 SUCLG1 与 mtDNA 复制和转录调节因子之间的相互作用。有趣的是，在 MV411 细胞中，内源性 SUCLG1 很容易与 POLRMT 和 TFAM 相关，但与 POLG 不相关（图 2K ）。团队关注 POLRMT，因为它直接介导 mtDNA 转录。团队从对照细胞和SUCLG1敲除细胞中免疫纯化 HA 标记的 POLRMT，以测试其翻译后修饰。SUCLG1的缺失会升高POLRMT赖氨酸琥珀酰化（suc-Lys），但不会升高其赖氨酸甲基化（me-Lys）、赖氨酸乙酰化（ac-Lys）或酪氨酸磷酸化（p-Tyr）（图 EV2K）。此外，异位表达或内源性POLRMT的泛素化没有表现出显着的变化（图EV2L，M）。值得注意的是，内源性 POLRMT 的琥珀酰化水平在SUCLG1敲除的 MV411 和 HL60 细胞中也上调（图 2L，M）。这些结果表明 SUCLG1 限制 POLRMT 琥珀酰化。

💡SUCLG1 限制琥珀酰辅酶 A 水平以下调 POLRMT 琥珀酰化

琥珀酰化以非酶促方式发生，允许线粒体琥珀酰辅酶A水平和目标蛋白琥珀酰化之间直接联系。为了探究琥珀酰辅酶 A 是否作为代谢信号来修饰 POLRMT，团队纯化了细菌表达的带有 His 标签的 POLRMT (POLRMT-His) 蛋白，并进行了体外琥珀酰化测定。与琥珀酰辅酶 A（而非琥珀酸）一起孵育，POLRMT 琥珀酰化呈剂量依赖性增加（图 EV2N）。接下来，团队从 MV411 细胞中免疫纯化 HA 标记的 POLRMT 和 Flag 标记的 SUCLG1，并将反应缓冲液与 SUCLG1-Flag 蛋白预孵育。体外琥珀酰化反应表明，SUCLG1-Flag 酶（而非其热灭活形式）抑制 POLRMT 琥珀酰化（图 2N）。SUCLG1 在体外限制琥珀酰辅酶 A 诱导的 POLRMT 琥珀酰化。此外，团队从 MV411 稳定细胞中免疫纯化 POLRMT。重新表达野生型SUCLG1，但不是其突变体，恢复了内源POLRMT的赖氨酸琥珀酰化（图 2O）。

线粒体转录依赖于充足的能量和核苷酸供应。为了测试 SUCLG1 和 POLRMT 之间的功能相关性，团队用丙酮酸和尿苷处理SUCLG1缺陷的 MV411 细胞，丙酮酸和尿苷分别支持线粒体呼吸和 RNA 合成。补充尿苷而不是丙酮酸，可以部分挽救SUCLG1耗尽细胞的线粒体呼吸和细胞增殖缺陷（图 2P-V和EV2O）。丙酮酸和尿苷联合处理并没有进一步增加耗氧量和细胞生长（图 2P-V和EV2O）。这些观察表明SUCLG1缺陷的细胞是尿苷营养缺陷型的。SUCLG1 可能参与调节线粒体转录。

💡K622 琥珀酰化抑制 POLRMT 活性

接下来团队研究了 POLRMT 琥珀酰化的生化效应。先前的蛋白质组分析表明，POLRMT 的赖氨酸 622 (K622)，一种进化上保守的残基（图 EV3A），可能被琥珀酰化。K622位于POLRMT的DNA结合沟处 (图 3A )。K622 处的琥珀酰化可能会因空间位阻而损害 mtDNA 结合并影响 mtDNA 转录活性。为了精确检测 POLRMT 琥珀酰化，团队生成了针对琥珀酰化 K622 的位点特异性抗体（抗 K622sc）（图 EV3B ）。

图3 . K622 琥珀酰化可抑制 POLRMT 活性

团队还将 K622 突变为精氨酸 (K622R) 或谷氨酸 (K622E)，以分别模拟其未修饰和琥珀酰化状态 (Qi et al, 2019)。团队对 HA 标记的 POLRMT 及其突变体进行了免疫纯化。抗K622sc抗体特异性识别野生型POLRMT，但不识别K622R或K622E突变体（图 EV3C）。Sirtuin 5 (SIRT5) 是一种线粒体脱酰酶，负责去除琥珀酰化修饰。SIRT5 的化学抑制显着增加野生型 POLRMT 的 K622 琥珀酰化，但不增加其突变体（图 EV3C）。这些结果表明 K622 是 POLRMT 的主要琥珀酰化位点。

💡SUCLG1在调节POLRMT琥珀酰化和线粒体功能中发挥着重要作用

为了确定 POLRMT 琥珀酰化的生理功能，团队将 HA 标记的 POLRMT 及其突变体重新表达到POLRMT敲除 MV411 和 HL60 细胞中（图 EV3D，E）。免疫共沉淀分析显示，与野生型 POLRMT 相比，POLRMT K622R与 TFAM 和 TFB2M 表现出更强的相互作用。相反，模拟琥珀酰化的 POLRMT K622E突变体表现出与线粒体转录因子的结合不足（图3B和EV3F）。此外，团队将针对SUCLG1 的shRNA 转导至POLRMT敲除和拯救细胞中。SUCLG1的耗尽导致免疫纯化的 POLRMT 过度琥珀酰化，同时伴有 POLRMT 与 TFAM 和 TFB2M 结合缺陷（图3B和EV3F）。值得注意的是，POLRMT 突变体的琥珀酰化在耗尽SUCLG1后发生了最小程度的改变（图3B和EV3F）。这些结果表明 SUCLG1 限制 POLRMT 的 K622 琥珀酰化以维持转录复合物的关联。

DNA 的糖磷酸主链带有负电荷，这为带正电荷的 K622 介导 POLRMT 与 mtDNA 结合提供了结构基础。团队推测 K622 琥珀酰化会破坏 POLRMT-mtDNA 关联并抑制线粒体转录。为了测试它，团队进行了线粒体基因组免疫沉淀 (MitoChIP) 测定，以确定 POLRMT 和 mtDNA 之间的相互作用。野生型POLRMT及其K622R突变体与mtDNA显着相互作用（图3C和EV3G）。POLRMT K622E模拟琥珀酰化状态，显示出与 mtDNA 的结合受损（图 3C和EV3G）。

图EV3. K622 琥珀酰化可抑制 POLRMT 活性

重要的是，野生型 POLRMT（而非其 K622 突变体）的 mtDNA 结合在SUCLG1敲除细胞（图 3C和EV3G）。接下来，团队使用放射性标记的 UTP 进行细胞器转录测定，以直接监测 POLRMT 活性。与野生型 POLRMT 相比，K622E 突变体不足以维持从稳定的 MV411 细胞分离的线粒体中的 UTP 放射性标记（图 3D，E）。POLRMT K622R突变体将线粒体转录恢复到与野生型POLRMT相似的水平，支持K622琥珀酰化在线粒体转录中的调节作用（图 3D，E）。

在 POLRMT WT拯救的细胞中， SUCLG1的耗尽强烈减少线粒体转录，但在 K622E 突变体拯救的那些中程度较小（图3D，E）。一致地，沉默SUCLG1有效降低了重新表达 POLRMT WT 的细胞中 mtDNA 丰度、mtDNA 编码基因表达和耗氧量，但在 K622 突变体拯救的细胞中降低程度较小（图 3F-H）。这些结果共同证明 SUCLG1 抑制 POLRMT 的 K622 琥珀酰化以维持线粒体转录。

💡揭示了SUCLG1 与有丝分裂生物发生和线粒体翻译之间的关联

琥珀酰辅酶 A 的信号传导作用表明其他 TCA 循环酶参与线粒体转录。在多种人类恶性肿瘤中发现了 SUCLG1 下游酶琥珀酸脱氢酶 (SDH) 的基因突变 。团队稳定地消耗了SDHA，并观察到 MV411 细胞中琥珀酸和琥珀酰辅酶 A 显着积累，同时内源性 POLRMT 的 K622 琥珀酰化增加（图 EV3H,I）。与这些发现一致，SDHA敲除细胞中 mtDNA 拷贝数和 MTG 强度均降低（图 EV3J,K）。因此，SDH 可能通过调节有丝分裂促进肿瘤的发生。

SUCLG1 催化 ADP 或 GDP 的底物水平磷酸化，这意味着 ATP 或 GTP 合成率高的细胞可能具有 POLRMT 低琥珀酰化和增加的有丝分裂生物发生。线粒体蛋白质翻译是一个高度消耗能量的过程，需要 ATP 和 GTP。团队研究了 POLRMT 琥珀酰化和线粒体翻译之间的潜在联系。MRPL45 是线粒体核糖体中决定蛋白质翻译活性的关键因素。癌细胞系百科全书的转录组显示，SUCLG1表达与MRPL45呈显着正相关。团队采用MRPL45低（Hs578T和HCC1806）和MRPL45高（KM12和A549）细胞系进行进一步分析。核苷酸定量显示，MRPL45高细胞系具有较高水平的ATP和GTP，同时伴随着POLRMT K622琥珀酰化的降低（图 3N，O）。POLRMT 琥珀酰化和能量产生之间的联系可能会耦合线粒体转录和翻译，以确保有效生产 mtDNA 编码的蛋白质。

💡白血病衍生的 FLT3 突变体上调 SUCLG1 以促进有丝分裂

AML 是一种遗传异质性恶性肿瘤，线粒体生物发生增强，导致其依赖于线粒体呼吸。为了确定重塑 AML 线粒体生成的遗传因素，团队在一组 AML 细胞系中测试了 POLRMT 琥珀酰化（图 4A）。来自三个不同健康供体的人类 CD34 + CB 细胞被纳入作为正常对照。对不同细胞系的内源性 POLRMT 进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹法测定 K622 琥珀酰化。有趣的是，SUCLG1蛋白表达与AML细胞系中的K622琥珀酰化呈负相关（图 4B）。

图4 . 白血病衍生的 FLT3 突变体上调 SUCLG1 以促进有丝分裂

团队进一步从测试的细胞系中提取代谢物并定量细胞琥珀酰辅酶A，其往往与POLRMT琥珀酰化呈正相关（图 4C）。FLT3 是一种膜结合酪氨酸激酶，约 30% 的 AML 患者发生突变（Antar 等人，2020）。在FLT3突变的细胞系(MONOMAC6、MOLM14和MV411)中，SUCLG1过表达，但SDHA、琥珀酸脱氢酶亚基B(SDHB)、富马酸水合酶(FH)、SIRT5或POLG过表达(图4A)。因此，与其他 AML 细胞系和健康对照相比 ， FLT3突变细胞中的 K622 琥珀酰化水平较低（图4A）。这些结果表明 FLT3 可能重塑 AML 细胞的有丝分裂。

💡FLT3 ITD以 SUCLG1 依赖性方式显着增加耗氧量和呼吸复合物活动

FLT3 酪氨酸激酶结构域 (TKD) 突变或内部串联重复 (ITD) 突变导致其组成型激活。为了测试 FLT3 是否调节有丝分裂，团队将 HA 标记的 FLT3 及其突变体过表达到 CD34 + CB 细胞中。FLT3 TKD和 FLT3 ITD突变体（而非野生型激酶）增强了 SUCLG1 表达并降低了琥珀酰辅酶 A 水平（图 4D、E）。一致地，过表达FLT3突变体减少了POLRMT琥珀酰化（图 4D）。mtDNA丰度、mtDNA编码基因表达、线粒体质量和细胞呼吸同时增加（图 4F-H和EV4A）。

同时，突变体FLT3 提高了SDH 的酶活性，但FH 的酶活性没有升高（图 EV4B、C）。用针对 SIRT5 的化学抑制剂处理 CD34 + CB 细胞会上调 POLRMT 琥珀酰化并减少 POLRMT 的 mtDNA 结合，同时伴随着 mtDNA 编码基因（MT-CO1、MT-ND6和MT-ATP6）表达的降低（图 EV4D-F）。在表达FLT3 ITD的细胞中，SIRT5抑制在较小程度上改变了POLRMT琥珀酰化和mtDNA结合（图 EV4D，E）。在 mtDNA 编码基因的 mRNA 表达中观察到类似的模式（图 EV4F）。内源性 POLG 的赖氨酸琥珀酰化在表达 FLT3 ITD的 CD34 + CB 细胞中保持不变（图 EV4G）。团队进一步耗尽稳定 CD34 + CB 细胞中的SUCLG1并测试线粒体呼吸。FLT3 ITD以 SUCLG1 依赖性方式显着增加耗氧量和呼吸复合物活动（图 4I-K）。

图EV4. 白血病衍生的 FLT3 突变体上调 SUCLG1 以促进有丝分裂

💡突变体FLT3上调SUCLG1以介导POLRMT低琥珀酰化并促进有丝分裂

接下来，团队在人白血病细胞中测试了FLT3对SUCLG1的调节。FLT3的遗传或化学抑制降低了MV411和MOLM14细胞中SUCLG1的表达，增加了琥珀酰辅酶A水平和免疫纯化的POLRMT的K622琥珀酰化（图 4L、M和EV4H-M）。更重要的是，在FLT3敲除的MV411细胞中，mtDNA丰度、mtDNA编码基因表达和线粒体质量均下降（图 4N-P）。此外，团队评估了FLT3突变状态是否与 TCGA AML 数据集中线粒体基因的 mRNA 表达相关。FH和POLG在FLT3中表现出增强的 mRNA 表达，但其他测试基因则不然-突变样本（图 EV4N）。有趣的是，用FLT3抑制剂（FLT3-IN-3和AC220）处理MV411细胞对SDH、FH、SIRT5和POLG蛋白表达的影响可以忽略不计（图 EV4O）。在FLT3抑制剂处理的MV411细胞中，SDH（而非FH）的酶活性降低（图 EV4P、Q）。

这些观察结果表明 SDH 表达和活性可能受到 SUCLG1 和 FLT3 信号传导的差异调节。化学抑制FLT3后，内源性POLG的赖氨酸琥珀酰化也没有表现出明显的变化（图 EV4R）。此外，团队将针对FLT3和SUCLG1的shRNA共表达到MV411细胞中（图 EV4S）。虽然沉默任一基因会降低耗氧量和呼吸复合物活性，但这两个基因的共同耗竭并不会导致线粒体呼吸进一步减少（图 4Q，R）。FLT3信号传导可能对不同的呼吸复合物具有特异性，因为复合物IV活性在FLT3敲除细胞中没有显着改变（图 4R）。然而，这些数据共同证明突变体FLT3上调SUCLG1以介导POLRMT低琥珀酰化并促进有丝分裂。

💡FLT3信号调节核转录以增强线粒体呼吸

突变体 FLT3 上调线粒体转录和线粒体生物发生，这意味着 FLT3 信号传导控制细胞核中一组更通用的线粒体基因。先前已在 MOLM14 和 MV411 细胞中描述了 FLT3 对白血病转录组的影响。团队收集了差异表达的线粒体基因（图 5A，B），其中25个基因在耗尽FLT3 后在两个细胞系中均强烈下调（倍数变化≥2； P <0.01） （图 5C）。团队验证了这些基因的 mRNA 表达在FLT3敲除的 MV411 细胞中降低（图 5D）。作为阴性对照的柠檬酸合酶(CS)的mRNA表达在FLT3敲除细胞中没有显着改变(图5D)。对这些基因的潜在启动子区域的分析揭示了至少三个不同的共有序列（图 5E-G和EV5A-C），这可能允许转录调节因子响应FLT3信号共同调节它们的表达。

图5 . FLT3 信号传导调节核转录以增强线粒体呼吸

图EV5. FLT3 信号传导调节核转录以增强线粒体呼吸

💡SUCLG1 抑制 POLRMT 琥珀酰化以支持白血病增殖

鉴于线粒体呼吸对于白血病生长不可或缺，团队研究了 POLRMT 琥珀酰化在白血病细胞中的病理生理功能。团队敲除MV411细胞中的SUCLG1并观察到细胞增殖的显着抑制（图 6A）。SUCLG1 WT的重新表达（而非其催化突变体）恢复了细胞生长（图 6A、B和EV6A）。用 POLRMT 特异性抑制剂处理强烈减少了 SUCLG1 WT拯救的细胞中的细胞增殖和集落形成，但未能进一步减少重新表达 SUCLG1 突变体的细胞的增殖（图6B和EV6A）。在用FLT3抑制剂处理SUCLG1敲除和拯救细胞后观察到类似的结果（图 EV6B，C）。这些数据表明 FLT3 和 SUCLG1 与 POLRMT 协同作用来调节白血病增殖。团队进一步评估了POLRMT敲除和拯救细胞的增殖。POLRMT K622R而非 POLRMT K622E的重新表达恢复了细胞增殖（图 6C）。

为了检查 POLRMT 琥珀酰化对细胞增殖的贡献，团队在POLRMT敲除和拯救细胞中耗尽了SUCLG1 。SUCLG1的缺失抑制了 POLRMT WT的增殖-拯救的细胞，但不是 POLRMT K622E -拯救的对应细胞（图6D和EV6D）。值得注意的是， SUCLG1的缺失还表现出在重新表达POLRMT K622R的细胞中具有生长抑制作用（图 6D和EV6D），这表明在白血病背景下SUCLG1和POLRMT之间的关系不是线性的。SUCLG1 可能具有调节 POLRMT 琥珀酰化以外的功能来支持白血病细胞增殖。

图6 . SUCLG1 抑制 POLRMT 琥珀酰化以支持白血病增殖

💡突变型FLT3诱导了SUCLG1的表达增加，从而抑制琥珀酰辅酶A水平

团队假设增强的线粒体发生可能赋予FLT3突变细胞对氧化磷酸化的依赖性。正如预期的，携带FLT3突变的细胞系在细胞存活测定中表现出对鱼藤酮（一种ETC复合物I抑制剂）的敏感性增加（图 6E）。此外，过表达FLT3 ITD提高了CD34 + CB细胞对鱼藤酮的敏感性(图6F)。

接下来团队在体内测试了白血病的发展。单独的FLT3 ITD不足以驱动白血病形成，团队将FLT3 ITD引入到MLL-AF9驱动的白血病模型中，如先前报道的（Stubbs等人，2008）。将HA标记的FLT3 ITD与MLL-AF9共转导至小鼠骨髓细胞中以建立小鼠白血病（图 6G）。此外，针对Suclg1或Polrmt 的shRNA在白血病骨髓细胞中稳定表达。将稳定的骨髓细胞移植到亚致死辐射的受体中（图 6H和EV6E）。耗尽Suclg1或Polrmt显着延长动物存活率（图 6I和EV6F）。与从培养细胞系获得的结果一致，Suclg1敲除组在 POLRMT K622R突变体环境中具有中等存活率。这一观察结果还表明 SUCLG1 酶活性或琥珀酰化的其他功能可能存在影响白血病的发展。SUCLG1 和 POLRMT 对于突变型FLT3驱动的白血病至关重要。

图EV6. SUCLG1 抑制 POLRMT 琥珀酰化以支持白血病增殖

💡SUCLG1的表达增加，进而增强了线粒体生物发生，推动白血病的进展

接下来，团队通过将稳定的 MV411 细胞移植到亚致死辐射的 NSG 小鼠中，建立了人源化白血病模型。在POLRMT敲除细胞中重新引入野生型POLRMT或POLRMT K622R将白血病进展恢复至类似水平(图 6J )。在重新表达POLRMT WT的MV411细胞中耗尽SUCLG1显着延迟了白血病的发展，而在用POLRMT K622R突变体建立的白血病模型中观察到较温和的抑制作用（图 6J）。此外，与 POLRMT WT组相比， POLRMT K622R组中 FLT3 的化学抑制延长动物存活的程度较小（图 EV6G）。这些数据表明，POLRMT 琥珀酰化是突变型 FLT3 促进白血病进展的主要目标。

为了确定 POLRMT 琥珀酰化的病理相关性，收集了人类正常和白血病骨髓样本并进行测序以确定FLT3突变状态。团队的研究总共纳入了 15 个不同的白血病样本（ 对于FLT3 WT AML，n = 5；对于带有FLT3 TKD/ITD 的 AML，n = 10 ）。测定了免疫纯化的 POLRMT 的全细胞裂解物和 K622 琥珀酰化中的蛋白质表达水平（图 EV6H）。代谢物定量显示，与健康对照相比， FLT3 WT和FLT3 TKD/ITD AML 样本中的琥珀酰辅酶 A 水平均降低（图 6K）。K622琥珀酰化在FLT3突变的AML中显着降低，而POLRMT蛋白表达没有观察到显着变化（图 6L和EV6I）。与该结果一致，SUCLG1蛋白在FLT3突变的AML样本中过度表达（图 6M）。重要的是，FLT3突变的 AML 样本具有增加的 mtDNA 拷贝和更高的MT-CO1 mRNA 表达，这表明线粒体生物发生增强（图 EV6J,K）。

团队在 TCGA AML 数据集中进一步研究了 SUCLG1 与白血病发展之间的关系。SUCLG1的 mRNA 水平在携带FLT3突变体的患者中显着升高（图 6N，O）。引人注目的是， SUCLG1的较高表达与FLT3 WT患者的总生存率较差有关，但在FLT3 TKD/ITD个体中则不然（图 6P）。这一观察结果还表明，FLT3 和 SUCLG1 可能存在调节线粒体生物合成并促进白血病发展的其他功能。

论文信息：

Yan W, Xie C, Sun S, et al. SUCLG1 restricts POLRMT succinylation to enhance mitochondrial biogenesis and leukemia progression. EMBO J. Published online April 22, 2024. doi:10.1038/s44318-024-00101-9.