案例分享010|LysC限制性酶切用于抗体半胱氨酰化修饰分析

半胱氨酸是蛋白质中活性最强的氨基酸之一，可与其他半胱氨酸形成二硫键，从而导致蛋白的二聚化和聚集。它还容易发生化学修饰，如谷胱甘肽化和半胱氨酰化。此次案例分享带来安进的研究人员在IgG分子中游离半胱氨酸的半胱氨酰化修饰相关方面的报道。

由于 IgG 分子的复杂性和异质性，检测 IgG 分子中的半胱氨酰化在分析上具有挑战性。在抗体药物分析中常用的一种技术是将分子还原成LC和HC，然后对每条链进行独立分析。单个链的大小比完整分子小得多，因此更容易分析。这种技术有助于鉴定修饰以及对HC和LC进行测序。然而，还原作用会消除半胱氨酸化，这是在未配对的半胱氨酸上检测不到半胱氨酰化的原因。

限制性蛋白水解是另一种从蛋白质中产生较小片段的技术。由于IgG分子的铰链区是柔性的且暴露在溶剂中，更容易被蛋白酶裂解。因此，通过使用蛋白酶Lys-C进行有限的蛋白水解，可以生成完整的Fab和Fc片段用于独立分析。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶等其他酶也被用来裂解HC的铰链区。与还原方法不同的是，有限的蛋白水解可保留二硫键结构和半胱氨酰化。

抗体完整分子量分析

安进报道的MAB007 是一个重组IgG单抗，它的独特之处在于其HC的 104位(CDR3上)存在一个未配对的半胱氨酸残基。从下图可以看到其完整分子量去卷积是非常复杂的，其中有多个相差约 140-150 Da 的峰。而在典型的抗体完整分子量谱图中，两个峰之间的差异通常是162Da（一个己糖）的差异。这些数据表明，MAB007 中还存在其他异质性来源，而且在去卷积谱图中观察到的质量差异是这些额外修饰与各种糖基化形式的组合。

LysC限制性酶切色谱图

在经 Lys-C 处理的 MAB007 的反相色谱图中可观察到两大类峰。较早洗脱的 Fc 片段显示出三个部分离峰（Fc1、Fc2 和 Fc3），而较晚洗脱的 Fab 片段显示出至少五个不同的色谱解析峰（Fab1、Fab2、Fab3、Fab4 和 Fab5）。

Fc色谱峰解析

在所有三个 Fc 峰中都可以观察到因N糖上半乳糖残基的缺失而导致的多个峰，其质量差为 162 Da。Fc1与Fc2以及Fc2与Fc3中对应峰的差异是129Da，分别是重链的K缺失了一个和2个引起的。研究人员提到他们生产的MAB007是由杂交瘤细胞生产的，而杂交瘤细胞中的羧肽酶活性是很弱的。因此，C端的K被切掉的很少。

Fab色谱峰解析

Fab4 峰的分子量为 47,281 Da，与计算得出的分子量 47,282 Da 非常吻合。Fab2峰的分子量比Fab4峰大119Da，推测是半胱氨酰化。Fab1比Fab2分子量大16Da，推测是氧化修饰；Fab3比Fab2少19Da，推测是天冬酰胺环化形成琥珀酰亚胺中间体；Fab5比Fab4小17Da，推测也是天冬酰胺环化形成琥珀酰亚胺中间体。

肽图分析确认半胱氨酰化修饰位点

抗体的常规肽图分析时需要将抗体进行还原和烷基化，前面提到这会破坏掉半胱氨酰化修饰。为了确认半胱氨酰化修饰位点，研究人员在对MAB007进行肽图分析的时候未进行还原。

游离的巯基在蛋白酶切通常使用的碱性条件下会发生反应，并可能引起二硫键错配。为防止出现这种干扰，在酶切前用 NEM 进行标记。

从液质肽图分析，约 127 分钟洗脱出的峰质量为 2696.8 Da，比含有残基 C104（Cys104 位于重链的 Fab 区）的 H10 肽（GGNWNCFDY WGQGTLVTVSSASTK）的理论质量 2577.8 Da 重 119 Da。H10 肽的非半胱氨酸化部分在大约 142 分钟时洗脱，其质量为 2699.3 Da，与 H10 的理论质量（包括因 NEM 标记而增加的质量）非常一致。

研究人员对 127 和 142 分钟洗脱的峰进行了识别，并通过 MS/MS 确定其相应的修饰为胱氨酰化（+119 Da）和 NEM（+125 Da）。

为了进一步证明观察到的 119 Da 质量差是由于半胱氨酰化造成的，研究人员还收集了肽图分析时半胱氨酰化形式的肽，并在质谱分析之前用 TCEP 对其进行了还原。下图 A 中可以观察到 m/z 1349.49 的双电荷离子，对应于半胱氨酰化的 H10 肽。还原后（图 B），在 m/z 1290 处观察到一个双电荷离子，对应的质量损失为 119 Da。如之前预测的一样，H10-Cys 肽的还原导致了 119 Da 的损失，进一步证实了该肽存在半胱氨酰化。

总结

这个案例给出了一种非限制性酶切获得抗体较小片段来进行一些翻译后修饰分析的方法。本人也尝试过这种方法，但总是把Fc给切碎了，怀疑是自己酶切体系太小，导致酶切过度。同事也尝试过Papain酶切制备Fab和Fc的酶切，发现小体积与大体积酶切会存在差异，小体积酶切会导致酶切过度。在这里提醒读者，在使用文献中的方法时注意酶切体系的大小问题。

此外，如之前文章里提到的各种蛋白表征工具酶，已经有好多特异性酶切的酶推出用于抗体表征分析。但是在制备级别，还是倾向于价格便宜的Papain、pepsin等。

附文中LysC限制性酶切方法

将 IgG 样品与蛋白酶 Lys-C 在孵育缓冲液（0.1 M Tris-HCl，pH 8.0）中以 400:1 的蛋白/酶重量比孵育，可实现有限的蛋白水解。孵育温度为 37°C，孵育时间为 30 分钟。加入醋酸将 pH 值降至4.5，终止反应。

参考文献：

Gadgil HS, Bondarenko PV, Pipes GD, Dillon TM, Banks D, Abel J, Kleemann GR, Treuheit MJ. Identification of cysteinylation of a free cysteine in the Fab region of a recombinant monoclonal IgG1 antibody using Lys-C limited proteolysis coupled with LC/MS analysis. Anal Biochem. 2006 Aug 15;355(2):165-74.