IF：64.8 | 一个药物可控的铜离子调节炎症巨噬细胞激活的通路

近日，法国居里研究院的Stéphanie Solier课题组就在Nature上发表了一项关于炎症的研究，题为：A druggable copper-signalling pathway that drives inflammation。✍该研究强调了铜作为细胞可塑性调节因子的核心作用，并揭示了一种基于代谢重编程和表观遗传细胞状态控制的治疗策略。

对于环境中复杂的物理和化学变化，细胞可以通过非遗传机制驱动快速适应，例如，肿瘤细胞在体内可以通过转变为侵袭状态进而迁移，从而使癌症得以转移；同样，免疫细胞也可以通过细胞状态的转化驱动炎症反应，进而修复组织。然而，炎症反应背后的分子基础尚未完全明确

研究背景

炎症是一个复杂的生理过程，可以清除病原体并修复受损组织。然而，由巨噬细胞和其他免疫细胞驱动的不受控制的炎症会导致组织损伤和器官衰竭。针对严重炎症的有效药物很少，并且需要治疗创新。

质膜糖蛋白CD44是透明质酸的主要细胞表面受体。它与生物计划有关涉及能够独立于遗传改变获得不同表型的细胞，这通常被定义为细胞可塑性。例如，炎性巨噬细胞的特征是CD44的表达增加，并且其在这种情况下的功能意义已经得到证明。然而，CD44和透明质酸影响细胞生物学的机制仍然难以捉摸。最近发现CD44介导癌细胞中铁结合透明质酸的内吞作用，将膜生物学与细胞可塑性的表观遗传调控联系起来，其中铁摄取的增加促进了参与基因表达调节的α-酮戊二酸（αKG）依赖性去甲基化酶的活性。透明质酸已被证明可诱导肺泡巨噬细胞 （AM） 中促炎细胞因子的表达，巨噬细胞活化依赖于染色质水平发生的复杂调节机制。这项工作提出了一个问题，即涉及CD44介导的金属摄取的一般机制是否调节巨噬细胞的可塑性和炎症。

在这里，我们表明巨噬细胞活化的特征是线粒体铜（II）的增加，这是由于CD44上调而发生的。线粒体铜（II）催化NAD（H）氧化还原循环，从而促进代谢变化和随后导致炎症状态的表观遗传改变。我们开发了一种二甲双胍二聚体，可使线粒体铜（II）失活。该药物诱导代谢和表观遗传转变，反对巨噬细胞活化并抑制体内炎症。

研究结果

🎯 CD44 介导细胞对铜的摄取

为了研究金属在免疫细胞活化中的作用，我们使用从血液中分离的人原代单核细胞生成了炎性巨噬细胞（图1）。活化的单核细胞来源的巨噬细胞（aMDMs）的特征是CD44、CD86和CD80的上调，以及不同的细胞形态（图1b）。

图1 CD44介导铜摄取

使用电感耦合等离子体质谱 （ICP-MS），与未激活的 MDM （naMDM） 相比，我们在 aMDM 中检测到更高水平的细胞铜、铁、锰和钙（图1c）。与其他金属转运蛋白相比，敲低CD44拮抗金属摄取（图1d），与CD44不同，这些其他金属转运蛋白的水平在巨噬细胞活化后没有增加（图1e）。用抗CD44抗体治疗MDM24活化时拮抗金属摄取（图1f）。相反，在活化时补充透明质酸会增加细胞对金属的吸收，而添加过甲基化透明质酸，不易发生金属结合，没有效果（图1g）。核磁共振显示透明质酸与铜相互作用（II），并且这种相互作用可以通过降低pH值来逆转（图1h）。荧光显微镜显示标记的透明质酸与溶酶体铜（II）探针共定位在 aMDM 中（图1i）。与降解透明质酸的透明质酸酶共同处理或敲低 CD44 还原溶酶体铜 （II） 染色（图 1i）。总的来说，这些数据表明，在 aMDM 中，CD44 介导与透明质酸结合的特定金属（包括铜）的内吞作用。

🎯 线粒体Cu（II）调节细胞可塑性

二甲双胍部分拮抗CD86上调，尽管浓度很高，但与其他铜靶向分子的边际效应形成鲜明对比（图2a）。为了降低形成双分子Cu（Met）2配合物27,28所固有的熵成本，我们将两个双胍与含亚甲基的连接剂结合，生成亲脂性铜夹LCC-12和LCC-4,4（图2b），它们分别包含12和4个连接亚甲基。LCC-4,4显示出远端丁基取代基，表现出与LCC-12相似的亲脂性。高分辨质谱（HRMS）证实了单金属铜双胍配合物的形成，其中Cu-LCC-12最稳定（图2c）。即使在低1000倍的剂量下，LCC-12也比二甲双胍更能拮抗aMDMs中CD86和CD80的诱导（图2d）。

图2 线粒体铜小分子失活剂的发展（ii）

使用click化学技术对具有生物活性的类似物-1c-12进行荧光标记，产生了与细胞色素c共定位的细胞质染色模式（图2e，f）。LCC-12,4与氯苯肼（CCCP）共处理后线粒体染色减少，CCCP是一种消散线粒体内部质子梯度的小分子，表明LCC-12在线粒体中的积累是由其质子化状态驱动的（图2g）。标记细胞中含有炔的小分子需要一个铜(i)催化剂，由添加的铜（ii）和抗坏血酸34-37原位生成。我们研究了aMDMs中的线粒体铜（ii）的含量是否允许在不需要实验性添加铜催化剂的情况下进行细胞内标记。荧光标记LCC-12,4使用浓度为100海里，低于LCC-12的生物活性剂量，发生在aMDMs没有添加铜（ii）和强染色只在aMDMs当抗坏血酸用于标记（图2h, i）。值得注意的是，敲除CD44会导致线粒体铜的显著减少（图2k）。这表明，与质子梯度不同，线粒体铜并不驱动双胍类物质的线粒体积累。

🎯 Cu（ii）调节NAD (H)氧化还原循环

aMDMs中较高的锰线粒体锰水平表明超氧化物歧化酶2（SOD2）在巨噬细胞激活环境中的功能作用。线粒体中SOD2蛋白的数量在激活后增加，而过氧化氢酶的数量减少（图3a，b）。线粒体过氧化氢是超氧化物歧化酶的产物和过氧化氢酶的底物，它也相应增加（图3c，d）。在铜（ii）存在的情况下，NADH与过氧化氢反应生成NAD+，而在铜（ii）不存在的情况下产生了复杂的氧化产物混合物（图3e）。在与线粒体中发现的反应条件下，在铜存在的情况下，NADH被迅速消耗产生NAD+（ii）（图3f）。LCC-12抑制了该反应，而LCC-4、4和二甲双胍的作用不大（图3f）。分子模型支持一种反应机制，其中铜（ii）激活过氧化氢，通过从NADH转移氢化物促进其还原。

图3 线粒体铜（ii）调节NAD (H)氧化还原循环

与naMDMs相比，aMDMs中的线粒体NADH水平较高，NAD+水平较低，表明依赖于NAD+的线粒体酶活性增强（图3g）。在激活过程中，用LCC-12治疗mdm会导致NADH和NAD+的降低（图3g）。这表明，铜（ii）催化NADH催化过氧化氢还原产生NAD+，双胍类化合物可以干扰这种氧化还原循环，导致其他氧化副产物（图3e）。

巨噬细胞的激活伴随着几种代谢物水平的改变，这些代谢物的产生依赖于NAD(H)（图3h）。lcc-12诱导的aMDMs代谢重编程以αKG和乙酰辅酶a（乙酰辅酶a）的减少为标志（图3i）。总的来说，这些数据支持了线粒体铜（ii）在维持调节炎症巨噬细胞代谢状态的NAD+池中的核心作用。

🎯 线粒体Cu（ii）调节转录

基因本体论（GO）分析显示了包括炎症、代谢和染色质（图4a）。值得注意的是，这些基因的GO术语包括内质网转运、细胞对铜离子的反应、对过氧化氢的反应和线粒体组织的正调控。暴露于不同病原体的巨噬细胞也获得了类似的特征，如氧化石墨烯术语和炎症相关基因RNA数量的增加（图4b）。aMDMs中涉及染色质和组蛋白修饰的基因上调，而在感染SARS-CoV-2个体的支气管肺泡巨噬细胞以及暴露于其他病原体的巨噬细胞中，编码铁依赖去甲基化酶和乙酰转移酶的类似基因上调（图4c）。这些数据表明，不同的病原体类别会引发类似的表观遗传学改变，导致细胞处于炎症状态。

图4：线粒体铜（II）调节炎性巨噬细胞的表观遗传状态和转录程序

染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）显示，在炎症基因位点上，允许性乙酰标志物H3K27ac,H3K14ac和H3K9ac的整体增加，同时抑制性甲基标志物H3K27me3和H3K9me2的减少，对aMDMs的转录谱产生一致的影响（图4d）。LCC-12治疗诱导了与NAD(H)和αKG代谢相关的基因下调，染色质调节和炎症的调节（图4e）。灭活线粒体铜(II)也促进了RNA和蛋白质水平上炎症基因的下调（图4f）。LCC-12治疗降低了H3K27ac,H3K14ac和H3K9ac，并增加了H3K27me3和H3K9me2水平，这与靶向炎症基因的下调相关（图4g）。因此，LCC-12诱导的αKG和乙酰辅酶A的降低分别与铁依赖性去甲基化酶和乙酰转移酶的活性降低相关。敲除CD44拮抗了aMDMs中炎症的表观遗传编程，而没有对其他金属转运体的表达产生不利影响（图4h）。总之，我们发现，在aMDMs中，通过抑制CD44的表达，可以减少αKG和αKG9的表达，从而降低αKG和αKG9的表达，从而降低αKG9的表达。这些数据表明，过氧化氢是细胞可塑性的驱动因素，而线粒体铜(II)控制着染色质修饰酶活性所需的必要代谢中间体的可获得性，从而实现快速转录变化，从而获得不同的细胞状态。

🎯 Cu（II）失活可减少炎症

从LPS和CLP小鼠模型中分离的小腹腔巨噬细胞（SPMs）以及从sars-cov-2感染小鼠中分离的AMs的炎症状态特征是CD44上调和细胞铜含量增加（图5a-c）。铜信号通路的效应因子，包括HAS和SOD2以及特定的表观遗传修饰因子，也在炎症巨噬细胞中表达上调。这些表观遗传修饰因子的组蛋白标记靶点也发生了相应的改变（图5d）。在lps处理的小鼠中，腹腔注射LCC-12可导致H3K27ac、H3K14ac和H3K9ac减少，H3K27me3和H3K9me2增加（图5d），这与炎症反应减少相关（图5e-g）。与这一结果相一致，腹腔注射LCC-12可以完全保护小鼠免受lps诱导的死亡并防止了体温的减少（图5h），且疗效优于用于急性炎症临床治疗的大剂量地塞米松。在CLP诱导的脓毒症中，LCC-12也提高了生存率（图5i）。总之，这些数据表明，靶向线粒体铜（ii）干扰了体内炎症状态的获得，并提供了治疗益处。

图5：线粒体铜的药理失活（II）可减轻体内炎症

研究总结

CD44先前曾被认为与癌症的发展、免疫反应和癌症进展有关。在这里，我们已经证明了CD44介导细胞对特定金属的摄取，包括铜，从而调节免疫细胞的活化。我们在线粒体中发现了一个化学反应的铜池（ii），它是巨噬细胞炎症状态的特征。我们的数据支持一种细胞机制，即铜激活过氧化氢（ii）使NADH得以氧化，以补充NAD+。维持这种氧化还原循环是产生关键代谢产物所必需的，这些代谢产物是表观遗传编程所必需的。在这种情况下，铜（ii）直接作为金属催化剂，而不是它在其他过程中的动态金属变构效应。暴露于不同类型病原体的巨噬细胞的转录组变化证实了这一机制的一般性质。

我们设计了一种双胍类二聚体，能够灭活线粒体铜（ii），从而触发代谢和表观遗传重编程，减少炎症细胞状态，增加急性炎症临床前模型的存活率。因此，我们说明了这一铜（ii）触发的分子链的病理生理相关性。因此，急性炎症让人想起一种代谢性疾病，这种疾病可以通过靶向线粒体铜（ii）来重新平衡，以限制启动和维持炎症状态所需的关键代谢物的产生。LCC-12选择性地靶向线粒体铜（ii），线粒体铜在疾病炎症细胞状态下比在基础状态下更丰富。该药物还干扰了癌细胞中EMT的过程，支持了该铜信号通路在炎症以外的转录变化的调节中发挥的更广泛的作用。因此，CD44可能是细胞可塑性的调节因子。二甲双胍对人类健康有积极作用，目前正在作为一种抗衰老药物进行研究。然而，其作用机制的研究由于其药理学差导致低效力，需要给予高剂量。因此，我们将lcc-12改名为“亚甲双胍”，比二甲双胍表现出更好的生物学和临床前特性，使其成为揭示新的双胍类药物样小分子。总的来说，我们的发现强调了线粒体铜（ii）作为细胞可塑性调节因子的核心作用，并揭示了一种基于表观遗传细胞状态控制和微调的治疗策略。