快报 | 靶向测序法和GeneXpert MTB/RIF技术在检测临床分离株和痰标本结核分枝杆菌的比

作者：张泓泰¹、代小伟¹、胡培磊、田丽丽、李传友、丁北川、杨新宇#、贺晓新 

第一作者：张泓泰、代小伟，单位：北京市疾病预防控制中心

通信作者及单位：杨新宇、贺晓新，单位：北京市疾病预防控制中心

Comparison of targeted next-generation sequencing and the Xpert MTB/RIF assay for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical isolates and sputum specimens 

Zhang H， Dai X，Hu P，Tian L， Li C，Ding B，Yang X，He X.

Microbiol Spectr，2024 Apr 11: e0409823. 

doi: 10.1128/spectrum.04098-23. Online ahead of print.

PMID: 38602399

背 景

   结核病（TB）是一种可预防并且通常可以治愈的疾病。在2022年，结核病是世界上第二大单一传染病死因（仅次于COVID-19），造成的死亡人数几乎是艾滋病的两倍。每年有超过1000万人继续感染结核病。

   最近在中国，靶向下一代测序（tNGS）作为一种分子检测工具用于检测结核感染和抗微生物药物耐药性（AMR）。该方法提供了快速、精确的分析，包括在比较短的时间内识别耐药性基因突变的能力。然而，tNGS和Xpert MTB/RIF在实验室和呼吸道标本中检测结核分枝杆菌（MTB）和AMR的比较尚未见报道。本研究的目的是比较评价tNGS和Xpert MTB/RIF在已建立的菌株和痰标本中识别MTB和AMR的检测性能。此外，还将tNGS与传统检测方法进行了比较。我们期望本研究可以为tNGS在临床环境中检测MTB和AMR的商业应用提供价值，最终指导患者的治疗，以及预防和控制与AMR相关的MTB。

方 法

   一、研究设计

   这是一项前瞻性、多中心、诊断准确性的研究。主要目的是：1)比较tNGS和Xpert MTB/RIF法在培养基中使用稀释系列临床分离株检测MTB的最低细菌检测限；2)比较tNGS、Xpert MTB/RIF、培养和涂片镜检对痰标本中结核分枝杆菌检测的敏感性和特异性；3)比较tNGS和Xpert MTB/RIF检测痰标本中AMR突变的敏感性；4)分析tNGS检测的MTB阳性样本中与AMR相关的基因突变。

   二、实验设计

   痰标本来自中国北京和长沙的129例疑似结核病患者，这些患者分别在北京市疾病预防控制中心和湖南省胸科医院接受治疗，其中38.8%（50/129）来自北京，61.2%（79/129）来自长沙。每个患者中收集的临床数据包括病史、临床检查结果以及可用的放射学和病理结果。所有参与者均提供了书面知情同意书。所有临床标本均采用涂片镜检、液体培养基培养、Xpert MTB/RIF检测和tNGS检测。

   三、统计分析

   采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数数据以“病例数”和“率”表示。采用McNemar检验对配对样本与其他诊断方法进行比较。在P<0.05时，差异有统计学意义。

结 果

   一、tNGS和Xpert MTB/RIF最低检测限及耐药性比较

   tNGS的最低检测限为102 CFU/mL，表明其对MTB的检测的敏感性略高于Xpert MTB/RIF（103 CFU/mL）。Xpert MTB/RIF在103-106 CFU/mL时都能检测到MTB，但它仅在106 CFU/mL时能检测到rpoBS450L突变。相比之下，tNGS在102-106 CFU/mL处鉴定出了MTB和S450L突变。突变信息并不局限于利福平耐药决定区（RRDR）。利用临床分离株数据作为参考，我们确定了tNGS和WGS在鉴定WHO目录中所有17,396个ARM相关突变位点方面的潜力。我们发现，在102-106 CFU/mL时，tNGS发现了与异烟肼和乙硫异烟胺相关的fabG1_c.-15C>T和fabG1_c.15C>T突变，以及与链霉素相关的rpsL_p.Lys88Arg突变，这与WGS的结果一致。

   二、tNGS、Xpert、培养和涂片镜检检测方法评估

   收集了129例患者的痰液，用于进行tNGS、Xpert MTB/RIF、培养和涂片镜检方法比较（表1）。以临床诊断为参考，tNGS的敏感性最高（48.6%；53/109），其次是培养（46.8%；51/109）、Xpert MTB/RIF检测（39.4%；43/109）和涂片镜检方法（34.9%；38/109）。最新的诊断方法tNGS的特异性为85%（17/20）。在检测一致性方面，培养（55.0%；71/129）最高，其次是tNGS（54.3%；70/129）、Xpert MTB/RIF（48.8%；63/129）和涂片镜检（45.0%；58/129）。在16例只在tNGS检测下均为结核病阳性的痰样本中，有13例患者也被临床诊断为结核病。此外，四种方法与临床诊断之间均有统计学差异（表1）。

    三、tNGS和Xpert MTB/RIF检测方法的比较

   在129份痰标本中，有67份在一种或两种分子检测方法下检测为阳性：tNGS检测56份为阳性，Xpert MTB/RIF检测有43份为阳性，有32份在两种检测方法下均为阳性（表2）。24份仅tNGS检测为阳性，11份仅Xpert MTB/RIF检测为阳性。tNGS与Xpert MTB/RIF之间的统计学差异（McNemar检验： P = 0.041，χ² = 25.245）表明这两种分子检测不能互换使用。

       四、tNGS和Xpert MTB/RIF在检测利福平耐药突变的比较

   使用在tNGS和Xpert MTB/RIF检测下均为结核阳性的32个样本，我们进一步评估了这两种检测方法在检测rpoB RRDR突变的性能。总共有7个样本中检测到RRDR突变：tNGS下检测到有6个样本有RRDR突变，Xpert MTB/RIF检测到有4个样本有RRDR突变的荧光信号（表3）。tNGS和Xpert MTB/RIF共同检测到3个样本具有RRDR突变。仅用tNGS检测到有3个样本具有RRDR突变。此外，我们发现仅有1例Xpert MTB/RIF检测到突变荧光信号，而tNGS未检测到RRDDR突变。

结 论

在本研究中，我们系统地比较了tNGS和Xpert MTB/RIF方法在检测MTB特异性核酸和实验室菌株rpoB S450L突变的性能。以WGS为标准，确认tNGS的准确性。tNGS作为一种分子检测方法比Xpert MTB/RIF在评估RIF耐药性和预测耐药性方面具有更大的应用价值。tNGS分子检测技术对于纠正初始诊断、进行相关基因突变的检测、耐药性预测、结核分枝杆菌耐药流行病学特征分析有广阔的适用性。

本文来自于“中国防痨杂志期刊社”公众号